肥胖症指的是体内脂肪堆积过多和(或)分布异常，体质量增加超出正常范围的一种病理状态。根据《2014年国民体质监测公报》数据显示，我国成人超重率为32.7%，老年人超重率为41.6%，成年人和老年人的肥胖率分别为10.5%和13.9%。该病作为代谢综合征的主要组分之一，与心脑血管疾病，呼吸系统疾病，2型糖尿病，恶性肿瘤等密切相关[1-3]。目前临床上服用西药治疗肥胖症存在诸多的不良反应，且远期疗效并不理想。因此寻找安全有效的抗肥胖药物已经成为医学上重要的课题。
中医认为肥胖的病机多与“痰湿”体质密切相关，往往还伴有气虚、血瘀等表现，加味温胆汤(出自《三因极-病证方论》)具有很好的益气健脾、化痰逐瘀之功。通过前期课题组对该方进行动物实验研究，发现其降脂减肥疗效显著[4-5]，临床上以该方为基础加减广泛运用到肥胖相关疾病的治疗中[6-8]，然而目前关于该方干预雌性大鼠脂质代谢紊乱的作用机制尚未见科学系统报道，故本实验旨通过研究不同剂量加味温胆汤对营养性肥胖雌性大鼠瘦素(LEP)，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和丙二酸单酰辅酶A(MCA)表达水平的影响，探讨该方有效改善雌性大鼠脂质代谢紊乱的作用机制及其量效关系，为临床应用提供科学的实验依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级SD雌性大鼠，30～35日龄，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(湘)2016-0002。本次实验开展经江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准，批准号JZLLSC：2017-0056。
1.2 药材
加味温胆汤组成为法半夏10 g(批号601123180)，竹茹10 g(批号600002004)，陈皮15 g(批号601001024)，枳实10 g(批号601052137)，黄芪15 g(批号601003467)，茯苓7.5 g(批号601003433)，白芥子10 g(批号500002981)，丹参10 g(批号301103856)，炙甘草5 g(批号401133319P)，均购自北京同仁堂(亳州)饮片有限公司，经江西中医药大学龚千锋教授鉴定均为正品。将每剂加味温胆汤加生姜5 g，大枣3 g，常规水煎，浓缩至含生药量1 g·mL-1，放入4 ℃冰箱，保存备用。
1.3 试剂
LEP，ACC酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉优尔生科技股份有限公司，批号分别为L170502216，L170601259)；trizol(美国Invitrogen公司，批号15596-026)；cDNA第一链合成试剂盒，Taq DNA Polymerase(美国Thermo Fisher公司，批号分别为K1622，EP0405)；琼脂糖(西班牙Biowest公司，批号111860)；电泳缓冲液(TAE)，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理后的70%乙醇，0.1%DEPC水(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号分别为KGM020，KGDN6，KGDN4500)；三氯甲烷、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)。
1.4 高脂乳剂配制
每100 mL乳剂内含煮鸡蛋黄20 g，全脂奶粉15 g，纯花生油10 g，蔗糖5 g，用料理机当日研磨均匀待用。鲜鸡蛋(南昌欧尚超市有限责任公司)，全脂奶粉(雀巢集团，合格证号20181130M1B6)，纯花生油(山东鲁花集团有限公司，批号WA2016123004679)。
1.5 仪器
BT25S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器公司)；CT14RD型低温冷冻离心机(北京天美科技有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；ELx800型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；WH-2型振荡器(上海沪西分析仪器厂)；DA7600型实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)仪(中山大学达安基因股份有限公司)；Tissuelyser-24型全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司)。
2 方法
2.1 分组和造模
雌性SD大鼠50只，经适应性饲养后，称取体质量随机分为5组，分别为正常组、模型组、加味温胆汤高、中、低剂量组，每组10只，均常温饲养(24±1) ℃并喂饲普通饲料，除正常组外，其余各组动物每天上午按10 mL·kg-1的量灌胃高脂乳剂，同时昼夜给予碳酸饮料(可口可乐)代替日常饮用水，连续2周后，将高脂乳剂大鼠重新打乱分组，建立营养性肥胖雌性大鼠模型。本实验依据前期课题组建立的方法复制营养性肥胖大鼠模型[4]。
2.2 给药
每天下午规定时间内分别灌胃相应剂量的加味温胆汤，同时正常组和模型组给予相同体积的纯净水灌胃，连续给药5周，给药同时依然隔日1次灌胃高脂乳剂，饮水不变。加味温胆汤给药剂量按照人与大鼠体表系数(0.018)进行换算，加味温胆汤高、中、低剂量组大鼠给药剂量分别是18.2，9.1，4.55 g·kg-1。
2.3 样本采集及处理
经末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，称体质量，麻醉取材。分离大鼠腹主动脉后，抽血6～8 mL，室温静置10 min后，6 500 r·min-1离心10 min，提取血清，用于检测LEP的表达水平。分离大鼠相同部位肝、腓肠肌组织各0.1 g左右，精细称质量，加9倍体积的预冷磷酸盐缓冲液(PBS)制成10%的组织匀浆液，并于4 ℃ 6 500 r·min-1离心10 min，分离上清液，用于检测肝和腓肠肌组织ACC的表达水平。分别取相同部位下丘脑和肝组织各0.1 g，锡箔纸包裹处理后放置于液氮中，用于Real-time PCR检测。分离大鼠肾和生殖器周围脂肪组织并称质量，用于计算大鼠脂肪指数。
2.4 指标检测
2.4.1 脂肪指数检测
脂肪指数＝脂肪质量/体质量×100%。
2.4.2 ELISA检测ACC，MCA和LEP的水平
严格按照ELISA试剂盒说明书分别检测大鼠血清LEP，肝和腓肠肌组织ACC的含量，根据酶标仪程序在450 nm波长依次测量各孔吸光度A。
2.4.3 Real-time PCR检测下丘脑LEP，MCA mRNA和肝ACC2 mRNA的表达
按照试剂盒说明书步骤进行trizol总RNA提取、反转录，Real-time PCR反应条件为95 ℃ 5 min使RNA酶失活，40个循环(95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s)扩增，95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s绘制溶解度曲线。相对表达量以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的表达水平，以GAPDH作为内参，用NCBI Primer Blast设计引物序列，由江苏凯基生物技术股份有限公司合成，引物序列见表1。
| 引物 | 序列(5′-3′) | 扩增产物/bp |
|---|---|---|
| ACC2 | 上游TGCTGAGATGGAGGTGATGAA | 81 |
| 下游CCTGGTCGCTTGATGTACTTC | ||
| MCA | 上游TGGTTCTCCTCTGGCTTCCTGAA | 85 |
| 下游CCTCACACTCGCTGATCTTCTGAA | ||
| LEP | 上游TTTCATGGGACAGCCAAACAAA | 114 |
| 下游GCAGAGATGTATCCGAGACGAT | ||
| GAPDH | 上游AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA | 130 |
| 下游CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG |
2.5 统计学方法
采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计学分析，数据以
3 结果
3.1 对雌性大鼠体质量和脂肪指数的影响
与正常组比较，给药5周后模型组大鼠体质量、脂肪指数明显升高(P<0.05)；与模型组比较，正常组大鼠体质量、脂肪指数明显降低(P<0.05)，加味温胆汤高、中、低剂量组均能不同程度降低肥胖大鼠体质量和脂肪指数，其中低剂量组降低大鼠脂肪指数效果尤为明显(P<0.05)。见表2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 原始体质量/g | 给药5周后体质量/g | 脂肪指数/% |
|---|---|---|---|---|
| 正常 | - | 216.89±9.79 | 257.25±19.98 | 3.201±0.806 |
| 模型 | - | 217.38±6.61 | 276.38±25.011) | 4.108±0.8481) |
| 加味温胆汤 | 18.2 | 217.56±9.55 | 266.25±24.61 | 3.958±0.769 |
| 9.1 | 216.89±9.06 | 270.38±19.97 | 3.607±0.809 | |
| 4.55 | 216.63±10.36 | 266.63±18.02 | 3.314±0.2562) |
3.2 对雌性大鼠下丘脑LEP mRNA和血清LEP的影响
与模型组比较，加味温胆汤高剂量组可明显下调大鼠下丘脑组织LEP mRNA的表达水平(P<0.05)，中、低剂量组可显著下调大鼠血清LEP和下丘脑组织LEP mRNA的表达水平(P<0.01)；与加味温胆汤高剂量组比较，中剂量组在下调大鼠下丘脑组织LEP mRNA效果最佳(P<0.01)，低剂量组次之(P<0.05)。见表3。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 下丘脑LEP mRNA | 血清LEP/μg·L-1 |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 3.471±1.93 | 0.453±0.082 |
| 模型 | - | 5.407±0.912) | 0.549±0.0931) |
| 加味温胆汤 | 18.2 | 3.152±1.303) | 0.477±0.085 |
| 9.1 | 1.207±0.374，6) | 0.429±0.0514) | |
| 4.55 | 1.806±1.184，5) | 0.419±0.0694) |
3.3 对雌性大鼠肝、腓肠肌ACC的影响
与模型组比较，加味温胆汤各组大鼠肝脏组织ACC含量未见明显变化，中、低剂量组腓肠肌组织ACC含量明显降低(P<0.05)；与加味温胆汤高剂量组比较，中剂量组大鼠腓肠肌组织ACC含量明显降低(P<0.05)。见表4。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 肝组织ACC | 腓肠肌ACC |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 51.56±9.26 | 24.23±5.15 |
| 模型 | - | 57.65±10.57 | 26.84±7.03 |
| 加味温胆汤 | 18.2 | 61.13±13.12 | 27.00±9.25 |
| 9.1 | 55.12±14.53 | 19.97±4.823，5) | |
| 4.55 | 57.05±8.25 | 20.06±4.963) |
3.4 对雌性大鼠肝ACC2 mRNA，下丘脑MCA mRNA的影响
与模型组比较，加味温胆汤高、中、低剂量组均能不同程度下调大鼠肝组织ACC2 mRNA和下丘脑组织MCA mRNA的表达水平。低剂量组明显降低肝组织ACC2 mRNA，下丘脑组织MCA mRNA的表达水平(P<0.05)；与加味温胆汤高剂量组比较，中剂量组在下调下丘脑组织MCA mRNA的表达水平显著优于高剂量组(P<0.01)。见表5。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 肝组织ACC2 | 下丘脑MCA |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 0.942±1.12 | 1.349±0.35 |
| 模型 | - | 1.029±1.10 | 1.635±0.291) |
| 加味温胆汤 | 18.2 | 0.416±0.623) | 1.506±0.22 |
| 9.1 | 0.622±0.68 | 1.277±0.214，6) | |
| 4.55 | 0.390±0.553) | 1.412±0.263) |
4 讨论
中医对肥胖症的认识历史悠久，如《黄帝内经·灵枢》记载：“此肥人也……其血黑以浊，其气涩以迟。”明·张景岳《景岳全书》指出“肥人多痰，乃气虚也。”清·陈修园认为：“大抵禀素之盛……惟是湿痰颇多。”经过前人对肥胖之人多痰、多虚、多瘀的辨证分析，以及现代医家对肥胖人群痰湿型、气虚型和痰湿挟瘀型体质的认识[9-11]，为实验和临床应用提供了更多的理论依据。故本实验所用的“加味温胆汤”是在《三因极—病证方论》中所载的治痰名方“温胆汤”基础上加入黄芪、白芥子和丹参3味中药，使全方在“祛痰”为核心的基础上，兼有益气健脾、化痰逐瘀之功，旨在增强减肥降脂疗效[12]。本实验将从LEP，ACC，MCA相关代谢蛋白及其mRNA的表达水平，探讨加味温胆汤有效改善大鼠脂质代谢紊乱的作用机制。
LEP是一种由167个氨基酸构成的神经内分泌激素，研究发现LEP不但可以由白色脂肪细胞产生外[13]，还可以由下丘脑、棕色脂肪、骨骼肌等组织释放。血液循环中的LEP能够和血浆蛋白结合进行转运，经特定途径通过血脑屏障，与脑内LEP受体等靶器官结合后，发挥调节进食量、能量消耗、神经内分泌功能和体质量指数(BMI)等作用[14-15]。人类血清LEP含量虽然存在个体差异性，但总体LEP浓度与肥胖程度成正比[16]。有研究报道营养性肥胖大鼠和肥胖患者存在血LEP水平升高，未能正常发挥抑制食欲，增加能量消耗并减少脂肪合成和储存的现象是因为LEP抵抗[17-18]，LEP抵抗可导致机体调节能量平衡作用减弱甚至消失，因此寻找以改善LEP抵抗为切入点防治营养性肥胖的药物具有重要意义[19]。
本研究显示，加味温胆汤高、中、低剂量组大鼠血清LEP含量和下丘脑LEP mRNA表达水平均呈现不同程度的下调趋势，且中、低剂量组下调幅度尤为显著。因此，笔者认为加味温胆汤抗雌性大鼠营养性肥胖的作用机制与调节大鼠LEP抵抗，增强下丘脑和血清中LEP的敏感性有关。
ACC作为脂肪酸氧化限速酶，可分为ACC1和ACC2两种亚型，其中ACC1主要分布在肝脏、脂肪等脂类合成和储存的组织中，ACC2主要分布在骨骼肌、心肌等脂肪分解的组织中。ACC1活化后可以促进机体脂肪的合成和储存，被下调后能够抑制组织中脂肪酸的合成。ACC2主要存在于线粒体中，其活性被抑制后，可以下调由其调控的下游产物MCA。有研究发现，中枢下丘脑组织MCA在调节动物的食物摄入量和能量平衡方面发挥重要作用[20]，当组织中MCA被抑制后可以抑制脂肪酸的合成、增加胰岛素敏感性，从而发挥加快脂肪酸氧化，降低脂质沉积的作用[21]。
本研究显示，加味温胆汤高、中、低剂量组对大鼠下丘脑组织MCA mRNA和肝组织ACC2 mRNA的表达水平均起到不同程度的下调作用，且中、低剂量组下调幅度有统计学意义。加味温胆汤高剂量组虽有上调肝、腓肠肌组织中ACC的趋势，但上调幅度未见统计学意义。综上所述，笔者认为加味温胆汤还能通过下调雌性营养性肥胖大鼠肝组织ACC2 mRNA和下丘脑组织MCA mRNA的表达水平，发挥改善机体脂质代谢紊乱的作用，且中、低剂量加味温胆汤效果更佳。
