中药治疗在我国肝癌综合治疗方案中发挥着重要作用。研究显示，以整体观念和辨证论治为特色、以“扶正祛邪”为抗肝癌理念的中医药治疗可以通过多层次、多靶点、多途径发挥抗肿瘤作用［1-2］。随着我国民族制药企业自主研发的中药创新药淫羊藿素软胶囊于2022年获批上市［3］，未来在肝癌研究领域可能会有越来越多的研究者开始关注从中药中发现潜在防治肝癌的先导天然化合物。实验研究是验证中药治疗肝癌疗效和阐明作用机理的重要方法之一，而随着生命科学技术的变革和交叉学科的引入，不同类型的实验也为研究中药治疗肝癌提供了新视角和方法，并产生了许多有价值的研究成果。在此背景下，系统地梳理和分析国内外中药治疗肝癌的实验研究，把握当前的主要研究现状和未来的研究趋势成为必要。本研究采用内容分析法，对2022年6月之前发表在国内外学术期刊上的中药治疗肝癌的实验研究文献进行统计与分析，归纳文献的发表概况、研究药物种类、肝癌模型类别、系统生物学技术的应用以及代表性药物研究概况，并简要评述研究现状，以期为中医药治疗肝癌相关研究提供参考。
1 资料与方法
1.1 文献来源
计算机检索Cochrane Library、Web of Science、PubMed、中国期刊全文数据库、中文科技期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库、万方医药期刊全文及学位论文数据库中中药治疗肝癌的实验研究。中文检索词：1）“中医药”OR“中药”，2）“肝癌”OR“肝肿瘤”，3）“实验研究”OR“机制研究”；检索方式：主题=1）AND 2）AND 3）。英文检索词：1）traditional Chinese medicine，2）liver cancer OR hepatocellular carcinoma，3）experimental study；检索方式：主题=1）AND 2）AND 3）。检索时间范围：各数据库建库至2022年5月31日。
1.2 文献纳入标准
1）中药治疗肝癌相关研究，研究类型为实验研究；2）中药复方、中药注射剂、药对和单味中药均纳入“中药”范畴；3）同一研究多次发表或相似文献仅纳入最先发表的1篇。
1.3 文献排除标准
1）Meta分析、数据挖掘、文献计量学、综述等二次研究文献；2）科普文章、会议摘要、新闻报道类文献；3）仅有摘要而无全文的文献。
1.4 文献信息提取
根据研究目标制定信息提取表，提取内容包括：文献发表年份、文献题目、药物名称、药物类型、肝癌模型、应用系统生物学技术种类。其中药物类型包括中药复方（组成药物大于2味）、药对（两味药物配伍）、单药；肝癌模型分为细胞模型和动物模型；系统生物学技术包括网络药理学技术、基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、单细胞测序。由两名研究者独立进行资料筛选和提取并核对，意见结果不一致则通过讨论或交由第三位研究者协助解决。
1.5 统计方法
采用EndNote 20.0软件筛选管理文献，采用Excel 2010对文献信息进行提取、统计，计数资料以频数及百分比（%）表示，采用Graphpad Prim 9绘制柱状图。
2 结果
2.1 文献筛选流程及结果
根据检索词获得文献2118篇，使用EndNote 20.0软件去除重复文献1244篇，其余874篇根据文献纳入标准及排除标准进行筛选，阅读题目、摘要后排除非中药治疗肝癌类文献105篇、无法获取全文3篇，阅读全文后排除综述文献10篇、重复文献9篇、临床研究类文献12篇，最终纳入分析的文献共计735篇，包括中文文献612篇，英文文献123篇。
2.2 文献发表概况
从时间分布来看，中药治疗肝癌的实验研究呈现逐年增长态势，2001年之前共发表文献18篇；2001-2005年开始增长，其间共发表文献26篇；2006-2010年文献发表数量呈现大幅度增长，共发表文献137篇；2011-2015年和2016-2020年保持了同上期的增长速度，期间分别发表了文献185篇和271篇；2021年至2022年5月31日共发表文献98篇（详见图1）。
2.3 研究药物种类概况
735篇文献中中药复方（因纳入研究的中药注射液均含有两种以上中药成分故将其归类为中药复方进行统计）治疗肝癌的实验研究文献532篇，占72.38%；药对治疗肝癌的实验研究文献18篇，占2.45%；单药治疗肝癌的实验研究文献185篇，占25.17%。735篇文献涉及361种干预药物，包含248个复方、13个药对和100个单药。根据发表文献数量，排在前三位的复方依次是扶正抑瘤方、鳖甲煎丸、小柴胡汤；排在前三位的药对分别是白花蛇舌草-半枝莲、当归-红芪、姜黄-海带；排在前三位的单药依次是白花蛇舌草、半枝莲、丹参，其具体使用频率详见表1。
| 复方 | 频数 | 频率/% | 药对 | 频数 | 频率/% | 单药 | 频数 | 频率/% |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 扶正抑瘤方 | 23 | 3.13 | 白花蛇舌草-半枝莲 | 3 | 0.41 | 白花蛇舌草 | 17 | 2.31 |
| 鳖甲煎丸 | 18 | 2.45 | 当归-红芪 | 2 | 0.27 | 半枝莲 | 9 | 1.22 |
| 小柴胡汤 | 9 | 1.22 | 姜黄-海带 | 2 | 0.27 | 丹参 | 7 | 0.95 |
| 清肝化瘀颗粒 | 8 | 1.09 | 南柴胡-赤芍药 | 1 | 0.14 | 叶下珠 | 5 | 0.68 |
| 扶正抗癌方 | 8 | 1.09 | 桃仁-红花 | 1 | 0.14 | 熊胆粉 | 5 | 0.68 |
| 叶下株复方Ⅱ号 | 7 | 0.95 | 三棱-莪术 | 1 | 0.14 | 黄芪 | 5 | 0.68 |
| 消癌平注射液 | 6 | 0.82 | 大戟-甘草 | 1 | 0.14 | 槐耳 | 5 | 0.68 |
| 复方苦参注射液 | 6 | 0.82 | 川楝子-延胡索 | 1 | 0.14 | 预知子 | 4 | 0.54 |
| 扶正消癥方 | 6 | 0.82 | 柴胡-郁金 | 1 | 0.14 | 仙鹤草 | 4 | 0.54 |
| 松友饮 | 6 | 0.82 | 白芍-柴胡 | 1 | 0.14 | 黄连 | 4 | 0.54 |
2.4 肝癌模型应用概况
735篇文献中有79篇文献是未进行实验验证的生物信息分析研究，有76篇文献采用细胞和动物两种模型，将其分别进行统计，则735篇文献中共有328篇文献所用模型为肝癌细胞株，有404篇文献所用模型为肝癌动物模型。排在前三位的肝癌细胞模型是HepG2、SMMC-2771、H22，排在前三位的肝癌动物模型是皮下移植瘤小鼠、化学诱导肝癌模型、原位肝癌模型，其具体使用频率详见表2。
| 细胞模型 | 频数 | 频率/% | 动物模型 | 频数 | 频率/% |
|---|---|---|---|---|---|
| HepG2 | 159 | 21.63 | 皮下移植瘤模型 | 312 | 42.45 |
| SMMC-7721 | 78 | 10.61 | 化学诱导模型 | 52 | 7.07 |
| H22 | 27 | 3.67 | 原位肝癌模型 | 17 | 2.31 |
| Bel-7402 | 24 | 3.27 | 质粒诱导模型 | 2 | 0.27 |
| Huh-7 | 22 | 2.99 | 转移性肝癌模型 | 2 | 0.27 |
2.5 系统生物学技术应用概况
系统生物学技术主要指网络药理学技术、基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、单细胞测序，735篇文献中有199篇文献采用了网络药理学技术（27.07%），6篇文献应用了转录组学（0.82%），3篇应用基因芯片（0.41%），3篇应用了代谢组学（0.41%），2篇应用了肠道菌群16S rDNA测序（0.27%），1篇应用了蛋白质组学分析（0.14%），尚无研究采用单细胞测序技术。
2.6 代表性药物研究分析
中药治疗肝癌的实验属于药物的临床前研究，运用细胞或动物肝癌模型模拟疾病生理病理状态，采用中药进行干预，联合已有的研究技术与手段对理论假设进行验证，可为药物的治疗效果和深入的具体作用机制提供扎实的研究数据支持。根据本研究结果，现选取三个临床应用较多且机制研究较为深入的中药治疗肝癌的代表性药物进行分析如下。
2.6.1 鳖甲煎丸
鳖甲煎丸由炙鳖甲、大黄、土鳖虫、蜂房等23味药物组成，具有软坚散结、活血祛瘀、行气利水等多种作用，主要用于肿瘤和肝纤维化的治疗［4］。鳖甲煎丸治疗肝癌的实验研究共有18篇，研究主要通过肝癌HCCLM3、HepG2细胞和Hepa1-6裸鼠移植瘤、二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝癌病变等模型，结果表明鳖甲煎丸可以抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、改善肝癌细胞微环境、恢复肝癌血管功能正常化等，从而起到控制肝癌发展、减少肝癌发生的作用，相关机制涉及细胞周期信号通路［5-6］、NF-κB信号通路［7］、STAT信号通路［8］、Wnt信号通路［9-11］等。鳖甲煎丸含药血清与肿瘤干细胞共培养和肿瘤干细胞建立原位移植瘤两种模型的研究则发现，鳖甲煎丸联合骨髓间充质干细胞可通过调控miR-140和Wnt/β- catenin信号通路抑制肝癌的发展［12-13］。
2.6.2 白花蛇舌草
白花蛇舌草属于清热解毒的药物，其抗肿瘤作用已得到广泛认可，目前常以配伍的形式用于肿瘤的治疗［14］。白花蛇舌草治疗肝癌的实验研究共17篇，研究主要采用H22、HepG2、Hep3B肝癌细胞和H22荷瘤小鼠模型，研究初步表明白花蛇舌草通过抑制肝癌细胞增殖、促使肝癌细胞凋亡、减少肝癌转移、提高机体免疫等作用发挥抗肝癌效果，具体机制与调控Bcl/Bax［15］、HSP70［16］等蛋白表达、抑制CDK2-E2F1通路［17］相关。
2.6.3 复方苦参注射液
复方苦参注射液由苦参、白土苓配伍而成，在临床上广泛用于癌症疼痛和出血，常与中药汤剂、中成药、化疗药等配伍使用，可起到提高疗效和减少不良反应等作用［18］。复方苦参注射液治疗肝癌的实验研究共有6篇，研究主要采用H22荷瘤小鼠、DEN诱导肝癌大鼠，结果均证实复方苦参注射液具有抑制肝纤维化、减少肝癌发生和增敏化疗药物疗效。值得一提的是，在Journal for Immunotherapy of Cancer［19］和Clinical and Translational Medicine［20］上发表的研究结果表明，复方苦参注射液可通过解除肿瘤相关巨噬细胞介导的免疫抑制，增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性而起到抗肝癌效果，并通过在肝星状细胞中重新平衡TGF-β/Smad7信号通路来抑制肝纤维化和预防肝癌发生。
3 讨论
以中医理论为指导运用中药治疗肝癌在临床上广泛应用。中医药可以通过多层次、多靶点、多途径发挥抗肿瘤作用，从而延长肝癌患者生存期、改善临床症状、提高生活质量［2］。中药治疗肝癌特别强调整体观念，扶正祛邪作为抗肝癌治疗理念已受到广泛认可［21-23］。但因多种组方形式、化学成分和多通路、多靶点的药理机制以及实验研究手段局限等因素，导致目前中药治疗肝癌的研究不够深入且进展缓慢，国际认可程度亦偏低。为促进中药治疗肝癌研究的不断深入，综合本研究结果，建议今后着重在以下方面开展研究。
3.1 立足于对中药的综合研究，提升研究的整体性与系统性
本研究纳入的735篇中药治疗肝癌实验研究文献中涉及361种干预药物，药物类型以复方为主但具体使用存在繁杂无序的现状。大部分的实验研究仅能阐明特定研究药物的作用机理，但无法解释“君、臣、佐、使”等中医组方用药规律。中药组方用药遵循方证相应原则，在辨证论治的基础上选择合适药物配伍而成，因此，同类方剂的药物组成具有共同点，也具有相同的治疗指征。针对目前治疗肝癌的中药种类繁多、用药规律研究较为薄弱的现状，今后的研究应着重整体性和系统性的指导原则。如中药可以按照药物特性类别划分，在研究药物作用机理的基础上，深入研究药物进行配伍后出现药效的叠加或者拮抗，方能对剖析中药的药效产生指导意义。
3.2 明确中药的药效物质基础，提升药物的可控性与应用性
基于复杂的化学成分，中药具有抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、提高机体免疫、减轻放化疗毒副作用等多种药效，可达到扶正祛邪、标本同治的目的，是中药治疗肝癌的优势；但同时也因为中药成分繁杂，一直存在安全性和质量控制等问题，阻碍着中药的应用和发展。如何阐明中药的药效物质基础是实验研究的关键环节。网络药理学是筛选中药药效物质，揭示靶点、药物与疾病靶点之间复杂关系的重要手段，具有系统性和整体性的特征，近年来已被广泛应用于中医药研究领域。在本次研究中，27.07%的文献采用了网络药理学技术，体现了网络药理学在中药复方实验研究中应用率高的特点。然而网络药理学难以体现真实的量效关系，且无法反映真实的药物成分。血清药理学和质谱技术作为新兴的药理学实验研究方法，有助于发现中药的潜在药效物质和阐明复方的有效成分，同时发现先导化合物，目前已经逐渐应用于中药药效学研究领域。将无数不明成分的中药转换为几种明确有效的成分组合，形成新的药物形式，将是未来研究的趋势之一，在此基础上再进一步分解成单一成分和不同成分组合后出现的药效效果将是很有意义的研究。
3.3 推动先进生物学技术应用，提升研究的创新性与突破性
中药治疗肝癌的实验研究中以分子生物学技术应用为主，以组学为代表的新兴系统生物技术在此研究领域应用极其有限。本研究结果亦显示，系统生物学技术在中药治疗肝癌研究领域中的应用率偏低，735篇纳入文献中仅有15篇应用了相关技术，单细胞测序甚至未见应用。基于外周血、组织病理、免疫组化等常规分子生物学手段已不能满足中药治疗肝癌实验研究的需求，而基因组学、转录测序、蛋白质组学、代谢组学和单细胞测序分别从基因、蛋白质、代谢物和细胞层面系统阐明药物对机体的影响，更符合多成分药物对机体影响研究的特点。充分借鉴系统生物学的核心研究平台可以实现中医肿瘤学在理论、方法、技术上的全面发展，阐释中药治疗肝癌的治疗靶点、作用机制等科学内涵，发现新的中医药疗法和药物。此外，多组学研究策略可补充单组学研究的不足，更加符合中医肿瘤学整体性研究的特征，可极大提升研究层次与质量。
实验研究作为中药治疗肝癌研究中的重要方面，目的是验证中药的临床疗效并阐明作用机制，为进一步临床应用提供依据。我们通过文献梳理，对涉及的研究药物、采用的肝癌模型、应用的生物学方法进行了归纳，发现中药组分在治疗肝脏恶性肿瘤方面的研究开发与应用，将会为肝癌的治疗提供更为有效的手段，拥有广阔的发展前景；系统生物学技术的整体研究、多变量整合、动态分析思想体系和方法策略与中医肿瘤学的思维方式具有趋同性，可以成为中医肿瘤学发展中的借鉴和补充。未来依托代谢组学、基因组学等新兴系统生物学技术平台，拓宽中医药治疗肝癌的物质基础及作用机制研究，将有助于肝癌中医诊治的标准化、系统化及规范化。
Compound kushen injection relieves tumor-associated macrophage-mediated immunosuppression through TNFR1 and sensitizes hepatocellular carcinoma to sorafenib
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