银屑病是以红斑、鳞屑、浸润为主要表现的自身免疫性疾病，除了T细胞活化在发病中扮演着重要角色，表皮通透屏障也被证实与银屑病的发生发展密切相关。研究表明，银屑病患者皮肤经皮水分流失增加、角质层含水量减少，表皮通透屏障受损，且外用润肤保湿乳膏的患者皮损严重程度指数(PASI)评分较治疗前明显降低，其中以鳞屑最为显著，表明表皮通透屏障的修复是临床治疗的重要手段之一[1-2]。紧密连接(TJ)作为表皮通透屏障的主要控制分子，被证实在银屑病患者皮损中存在异常表达。TJ的异常可引起水分的异常丢失、角质细胞的异常增殖分化，炎性细胞的迁移浸润，从而表现为皮肤干燥脱屑，浸润增厚[3]，但是中药对紧密连接的调节作用却不甚明确。
血燥证是银屑病慢性病程的主要证候，多是风邪燥热之邪久羁，阴血内耗，夺津灼液则血枯槁而难荣于外。表现为皮损淡红，鳞屑减少，干燥皲裂，自觉瘙痒，伴有口咽干燥，难治反复，迁延不愈。首都医科大学附属北京中医医院皮肤科联合多家医院对血燥证的治疗进行了深入研究，形成治疗银屑病血燥证的优化方案——养血解毒方。临床研究发现银屑病血燥证患者经养血解毒方治疗后优于安慰剂对照组8周总有效率67.09%，PASI评分优于安慰剂组，瘙痒症状较前明显缓解[4]。有研究观察到养血解毒方可减少银屑病患者经皮水分丢失[5]，但具体机制未明。本研究在以上基础上，从具有调节表皮屏障作用的细胞间连接-紧密连接功能入手，通过体内外研究，阐明养血解毒方治疗银屑病血燥证的作用机制，为养血解毒方治疗银屑病的临床应用提供生物学证据。
1 材料
1.1 动物及细胞
C57BL/6J雄性小鼠，体质量20～22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证号SCXK(京)2014-0004，饲养于北京市中医研究所SPF级动物饲养间，恒温(25 ℃)，恒湿(75%)，饮水、饲料不限。永生化人角质形成细胞株(Hacat细胞系购自中国医学科学院协和细胞中心)。文章中动物实验已得到北京市中医研究所实验动物管理委员会批准，伦理号为2018100202。
1.2 药物与试剂
咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司，批号16110239)；甲氨喋呤片(上海信谊药厂有限公司，批号036160702)；养血解毒方(当归15 g，生地黄15 g，丹参15 g，鸡血藤15 g，麦冬10 g，玄参15 g，土茯苓30 g，七叶一枝花9 g，天花粉15 g，白花蛇舌草30 g，苍术10 g，白蒺藜10 g)；养血组分(当归15 g，生地黄15 g，丹参15 g，鸡血藤15 g，麦冬10 g，天花粉15 g，苍术10 g，白蒺藜10 g)；解毒组分(玄参15 g，土茯苓30 g，七叶一枝花9 g，白花蛇舌草30 g)；将养血解毒方按成人(60 kg)剂量根据人与动物间换算比例计算小鼠用量，中药材统一由首都医科大学附属北京中医医院中药房提供并制成煎剂，质量浓度1 948 g·L-1。养血组分、解毒组分、养血解毒方喷干粉用喷雾干燥法制备，药材、水煎剂、喷干粉均由北京市中医研究所制剂室韩旭阳主管药师进行质控。细胞增殖毒性检测试剂盒-8(CCK-8，日本Dojindo公司，批号NM658)；白细胞介素-17A(IL-17A，美国Peprotech公司，批号1206392B1612)；过氧化物酶封闭液，DAB显色液，荧光封片剂(中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为K183316B，K187721A，K186616J)；MEM培养基，胎牛血清，ki67兔抗鼠多克隆抗体，CD3兔抗鼠单克隆抗体，表皮兜甲蛋白(loricrin)兔抗鼠多克隆抗体，水闸蛋白(claudin)-1兔抗鼠多克隆抗体，claudin-7兔抗鼠多克隆抗体(德国Abcam公司，批号分别为1967783，42Q3182K，GR3196370，GR3254868，GR3213869-2，GR3196024-1，GR3257288-2)；闭锁蛋白(occludin)，β-肌动蛋白(β-actin)兔抗鼠多克隆抗体(美国Proteintech公司，批号分别为00050249，00054323)；山羊抗兔488荧光二抗(北京冠星宇公司，批号#1712)；BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司，批号TL276913)。
1.3 仪器
TP1020型组织脱水机，EG1140H型包埋机，AUTOSTAINERXL型苏木素-伊红(HE)半自动染色仪(德国Leica公司)；IMAGER Z2型正置荧光显微镜及图像分析系统(德国Zeiss公司)；Axio Imager A2型蔡司光学显微镜(德国卡尔蔡司公司)；MCo-15AC型二氧化碳培养箱，MultiSkan3型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；XDS-2B型倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)；细胞培养板，培养瓶(美国Corning公司)。
2 方法
2.1 分组、造模及给药
用咪喹莫特诱导银屑病样皮损的经典模型[6]，给药组药物剂量参考课题组前期实验结果选用效果最优剂量[7]。实验前C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(80 mg·kg-1)，背部去毛约2 cm×2 cm大小。随机分为空白组、模型组、甲氨喋呤组、养血解毒方组，备皮后单笼饲养。除空白组外，其余3组小鼠予每日背部涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，空白组小鼠每日背部涂抹等量凡士林。造模同时灌胃给药，阳性药组予甲氨喋呤(1 mg·kg-1，9%生理盐水溶解)，养血解毒方组予养血解毒方水煎剂(38.96 g·kg-1)，空白组和模型组予生理盐水，每天1次，每次0.2 mL。造模给药共6 d，于第7天取材。
体外实验选用Hacat细胞系，状态良好消化重悬后接种于细胞板，饥饿同步后，予相应药物和刺激剂。模型采用1 mg·L-1的IL-17进行诱导[8]。实验共分为空白组，模型组，养血组分组(0.25 g·L-1)，解毒组分组(0.125 g·L-1)，养血解毒方组(0.5 g·L-1)。
2.2 检测指标及方法
2.2.1 小鼠银屑病样皮损表现及严重程度评分
相机记录每日皮损变化，并依据银屑病皮损面积和疾病严重程度标准从鳞屑、浸润、红斑3个方面评价给分，得分相加为总积分，PASI评分标准为0分(无)：表面无红斑鳞屑可见、皮损与正常皮肤齐平；1分(轻度)：部分皮损表面上覆有鳞屑，以细碎鳞屑为主、皮损轻微高于正常皮肤表面、呈淡红色；2分(中等度)：大多数皮损表面完全或不完全覆有鳞屑，鳞屑呈片状、中等度隆起，斑块边缘为圆或斜坡状、红色；3分(重度)：几乎全部皮损表面覆有鳞屑，鳞屑较厚呈层、皮损肥厚，隆起明显、深红色；4分(极重度)：全部皮损。对各组小鼠的各项评分取平均值以时间为横坐标绘制趋势线，观察各组小鼠皮损的动态变化情况。
2.2.2 小鼠皮肤表皮水分含量检测
使用水油测试笔在第7天造模结束后，对各组小鼠背部皮损处进行表皮水分含量检测。每只小鼠取同样部位进行检测，每只小鼠检测3次后取平均数，以观察各组小鼠角质层含水量的情况。
2.2.3 苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠皮损组织形态学改变
小鼠处死后，剪取皮损处皮肤，用10%甲醛进行固定，脱水包埋、切片及HE染色。每个标本选4张染色切片观察组织病理学改变，并在20倍及40倍物镜下拍照，对40倍物镜下图片采用ZEN图像分析系统测量表皮厚度。
2.2.4 小鼠皮损的表皮细胞增殖(ki67)和分化(loricrin)
分别采用免疫荧光法和免疫组化法检测小鼠皮损ki67和loricrin标记的表达。石蜡切片经脱蜡及抗原修复后，过氧化物酶封闭液室温封闭10 min，山羊血清工作液37 ℃孵育30 min后，ki67(1∶400)，loricrin(1∶200)一抗过夜孵育；ki67用488标记荧光二抗(1∶800)37 ℃孵育1 h后，用含DAPI的封片剂封片；loricrin用羊抗兔增强酶标免疫球蛋白G(IgG)抗体37 ℃孵育1 h后显色封片。显微镜下观察各组表达情况。
2.2.5 免疫组化法检测小鼠皮损的CD3＋T细胞浸润情况
检测步骤同2.2.4项。一抗浓度为1∶50。显微镜下观察各组中CD3＋T细胞的浸润情况。
2.2.6 免疫组化检测小鼠皮损的紧密连接蛋白claudin-1，claudin-7，occludin的表达
采用免疫组化法检测小鼠皮损中的claudin-1，claudin-7，occludin的表达定位。检测步骤同2.2.4项，一抗浓度均为1∶200，显微镜下观察各组蛋白的定位及表达情况。
2.2.7 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠皮损的紧密连接蛋白claudin-7，occludin蛋白的表达
研磨提取皮肤组织蛋白，BCA试剂盒进行定量，加5倍loading buffer高温变性后，经电泳、快速电转，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，磷酸盐聚山梨酯缓冲液(PBST)稀释一抗，claudin-7(1∶100)，occludin(1∶1 000)，4 ℃摇床过夜，二抗PBST稀释(1∶1万)，室温摇床避光孵育1 h后，扫膜获得图像。软件Image J对条带进行灰度值分析。
2.2.8 CCK-8法检测各组喷干粉对Hacat细胞的毒性
Hacat细胞1万/孔接种于96孔板，贴壁24 h后洗去血清，饥饿24 h后，加入各浓度药物，干预6 h后，洗去药物，加入10%CCK-8检测液，孵育2 h后酶标仪450 nm波长检测吸光度A，应用Graph Pad Prism 6对数据进行分析。
2.2.9 细胞免疫荧光检测Hacat细胞中claudin-1，claudin-7，occludin的表达
Hacat细胞3万/孔接种于24孔板，贴壁24 h后，洗去血清，饥饿24 h后，除空白模型组外加入各组药物预干预6 h后，洗去药物，除空白组外，每组加入1 mg·L-1的IL-17干预3 h后。经固定、通透、封闭后，一抗孵育过夜，claudin-1(1∶50)，claudin-7(1∶50)，occludin(1∶100)；二抗用488标记荧光二抗(1∶800)37 ℃孵育1 h后，含DAPI的封片剂封片。正置荧光光学显微镜下观察各组细胞的蛋白表达情况。
2.3 统计学方法
采用Graph Pad Prism 6分析软件进行单因素方差分析，实验数据以
3 结果
3.1 养血解毒方对银屑病样小鼠皮损表现及严重程度评分的影响
空白组小鼠背部皮肤光滑，无红斑、鳞屑，颜色为肉红色。随着药物的涂抹，模型组皮损日益加重，与空白组比较，皮肤颜色逐渐变深，聚为红斑、鳞屑增多、皮肤浸润增厚明显，出现类似银屑病样皮损；与模型组比较，甲氨嘌呤组皮损明显改善，鳞屑覆盖明显减少，红斑减少，浸润明显减轻；养血解毒方组皮损明显减轻，鳞屑、红斑减少，皮肤明显变薄。PASI评分趋势图提示，见图1，各组小鼠在用药的第2天，出现了红斑、鳞屑、浸润等表现；各组用药3 d后在以上方面出现了较为明显的差异；在总积分图中，可看出模型组最为严重；与模型组比较，养血解毒方组严重程度明显降低，疾病发展趋势缓慢，甲氨嘌呤组皮损严重程度最轻。见图1。
3.2 养血解毒方对银屑病样小鼠表皮水分含量的影响
水油笔检测结果，与空白组比较，模型组小鼠第7天表皮含水量显著降低(P<0.01)；与模型组比较，甲氨喋呤组和养血解毒方组小鼠表皮含水量显著升高(P<0.01)；与甲氨喋呤组比较，养血解毒方组小鼠皮损表皮含水量明显升高(P<0.05)。见表1。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 含水量/% |
|---|---|---|
| 空白 | - | 33.67±1.05 |
| 模型 | - | 17.20±0.521) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 24.18±0.623) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 27.42±0.833，4) |
3.3 养血解毒方对银屑病小鼠表皮病理学变化的影响
造模给药6 d后，空白组皮肤表皮薄，仅2～3层，皮下淋巴细胞浸润较少。模型组小鼠皮肤表皮层显著增厚，真皮大量淋巴细胞浸润，表皮突延长，角化不全，角质层细胞遗留细胞核，表皮棘层肥厚，基底细胞核分裂较多，类似银屑病样皮损改变。与模型组比较，给药组表皮厚度不同程度变薄，且角化不全细胞明显减少，淋巴细胞浸润也有不同程度减少。与空白组比较，模型组表皮显著增厚(P<0.01)；与模型组比较，甲氨喋呤组和养血解毒方组表皮厚度显著减少(P<0.01)；养血解毒方组和甲氨喋呤组相比无明显差异。见图2，表2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 表皮厚度/μm |
|---|---|---|
| 空白 | - | 12.23±0.37 |
| 模型 | - | 89.35±6.601) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 43.43±2.333) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 42.79±2.453) |
3.4 养血解毒方对银屑病样小鼠表皮ki67，loricrin表达的影响
绿色标记为阳性，空白组有极少量的阳性点分布在表皮基底层；与空白组比较，模型组中阳性点分布层数显著增多(P<0.01)，约3～4层；与模型组比较，甲氨喋呤组中阳性点分布显著减少(P<0.01)，基本呈单层线状分布。与模型组比较，养血解毒方组中阳性点显著减少(P<0.01)，分布占据1～2层。见表3。免疫组化法检测各组小鼠皮损组织loricrin的表达情况，在空白组中，loricrin主要表达在表皮的角质层，呈连续线性分布。与空白组比较，模型组中loricrin表达量明显减少，且染色渐至颗粒层；与模型组比较，甲氨喋呤组和养血解毒方组增加了loricrin的表达，且与甲氨喋呤组相比，养血解毒方组还可将loricrin浓缩至角质层，促进形成角质层屏障。见图3。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | ki67阳性细胞数/个 | loricrin |
|---|---|---|---|
| 空白 | - | 5.20±0.73 | 16.40±0.76 |
| 模型 | - | 85.00±3.721) | 6.50±0.781) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 30.00±2.073) | 12.47±0.443) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 35.20±3.063) | 14.60±0.813) |
3.5 养血解毒方对银屑病样小鼠真皮CD3＋T细胞浸润的影响
CD3标记真皮中的T淋巴细胞。免疫组化法检测各组小鼠皮损中CD3表达，棕色颗粒沉淀为阳性点。在空白组中，真皮中少量棕色阳性颗粒，表皮未见棕色阳性颗粒。与空白组比较，模型组中真皮棕色阳性颗粒显著增多，表皮也出现棕色沉淀(P<0.01)；与模型组比较，甲氨喋呤组和养血解毒方组CD3＋T淋巴细胞浸润显著减少(P<0.01)。见图4，表4。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | CD3阳性细胞数/个 |
|---|---|---|
| 空白 | - | 1.40±0.25 |
| 模型 | - | 12.20±1.931) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 4.00±0.553) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 4.80±0.803) |
3.6 养血解毒方对银屑病样小鼠表皮紧密连接蛋白claudin-1，claudin-7，occludin表达的影响
在空白组中，claudin-1，claudin-7均标记表皮细胞胞膜，表达连续，呈完整网状。occludin主要标记表皮细胞膜，胞浆也有少量表达，表达连续；与空白组比较，模型组中3种蛋白的表达均显著降低(P<0.01)，且表达完整性严重破坏，其中occludin标记表皮全层出现异常定位。与模型组比较，甲氨喋呤组和养血解毒方组可不同程度增加3种蛋白的表达量(P<0.05，P<0.01)，且一定程度恢复表达的完整连续性。与甲氨喋呤组相比，养血解毒方组在claudin-1，occludin的表达增加上作用更好(P<0.05)。见图5，表5。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | claudin-1 | claudin-7 | occludin |
|---|---|---|---|---|
| 空白 | - | 0.128±0.014 | 0.257±0.008 | 0.239±0.012 |
| 模型 | - | 0.049±0.0061) | 0.165±0.0031) | 0.154±0.0091) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 0.078±0.0032) | 0.203±0.0073) | 0.187±0.0012) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 0.119±0.0073，4) | 0.265±0.0252) | 0.224±0.0093，4) |
与空白组比较，模型组的claudin-7，occludin的表达量均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，甲氨喋呤组的claudin-7，occludin的表达量均升高(P<0.05)；与模型组比较，养血解毒方组的claudn-7和occludin明显升高(P<0.05，P<0.01)。在occludin的表达上，养血解毒方组较甲氨喋呤组有升高趋势，但无统计学差异。见图6，表6。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | occludin/β-actin | claudin-7/β-actin |
|---|---|---|---|
| 空白 | - | 0.650±0.013 | 0.466±0.012 |
| 模型 | - | 0.455±0.0151) | 0.233±0.0271) |
| 甲氨喋呤 | 0.001 | 0.602±0.013) | 0.395±0.0412) |
| 养血解毒方 | 38.96 | 0.637±0.0353) | 0.386±0.0352) |
3.7 养血组分、解毒组分、养血解毒方对Hacat细胞活性的影响
养血组分组在0.25 g·L-1，解毒组分组在0.125 g·L-1，养血解毒方组在0.5 g·L-1处显示出对Hacat细胞无毒性，因此分别选用0.25 g·L-1的养血组分，0.125 g·L-1的解毒组分，0.5 g·L-1的养血解毒方药物继续实验。见图7。
3.8 养血组分、解毒组分、养血解毒方对IL-17诱导的Hacat表达claudin-1，claudin-7，occludin的影响
与空白组比较，模型组的3种蛋白表达均显著降低(P<0.01)；与模型组比较，解毒组分组在3种蛋白的表达上均无明显变化；养血组分显著增升高claudin-1，claudin-7表达(P<0.01)，也升高occludin的表达(P<0.05)；养血解毒方组显著升高claudin-7，occludin表达(P<0.01)，明显升高claudin-1的表达(P<0.05)。见图8，表7。
| 组别 | 剂量/g·L-1 | claudin-1 | claudin-7 | occludin |
|---|---|---|---|---|
| 空白 | - | 0.109±0.009 | 0.152±0.007 | 0.201±0.002 |
| 模型 | - | 0.062±0.0071) | 0.081±0.0071) | 0.129±0.0151) |
| 养血组分 | 0.25 | 0.131±0.0033) | 0.133±0.0033) | 0.180±0.0112) |
| 解毒组分 | 0.125 | 0.064±0.004 | 0.078±0.008 | 0.143±0.008 |
| 养血解毒方 | 0.5 | 0.127±0.0063) | 0.148±0.0142) | 0.179±0.0082) |
4 讨论
皮肤是人体免疫系统的第一道生理屏障，表皮通透屏障功能一直以来都是皮肤科临床工作中十分关注的热点。紧密连接是形成表皮通透屏障的重要部分，主要在表皮颗粒层发挥作用，形成有效的渗透性阻隔，维持内环境的稳态[8]。紧密连接蛋白可分为跨膜蛋白和胞浆蛋白。常见的跨膜蛋白有occludin和claudins，跨膜蛋白在细胞外与相邻细胞的跨膜蛋白相互作用，形成“拉链样”吻合结构从而封闭细胞间隙；跨膜蛋白的胞内域与胞浆蛋白(ZO蛋白家族)等胞内蛋白相互连接，后者作为桥梁连接跨膜蛋白和细胞骨架蛋白，使细胞间紧密连接形成网状结构[9-10]。新近研究表明，表皮细胞紧密连接功能障碍参与银屑病的发病[11-12]，表皮紧密连接的异常可引起表皮细胞异常的增殖分化[12]，进而破坏角质层屏障，增加经皮水分丢失；而皮肤屏障功能障碍时，皮肤保水功能减弱，水分流失增加，pH升高，皮肤增厚明显[13]；另外，破坏的紧密连接为免疫细胞的迁移提供便利，加重免疫反应[11]；几个方面者相互作用，维持着皮损的慢性炎症反应，最终表现为皮肤增厚、干燥，疾病迁延难愈。因此，银屑病治疗时，除了针对免疫细胞异常活化外，打破“紧密连接失调—表皮细胞异常增殖分化—皮肤屏障功能受损—加重炎症—紧密连接进一步破坏”的环路，修复表皮屏障功能是防治银屑病的重要手段。
中医药治疗银屑病有着独特的优势，“从血论治”的血分辨证体系已得到行业的普遍认可。北京多家医院大样本流行病学研究发现血热证、血燥证、血瘀证为银屑病基本证候，血燥证占27.4%[14]。虽然血燥证比例不是最多，但与血热证易缓解、时程短及自愈倾向相比，其病程绵长，皮损持续存在，难以消退，是银屑病治疗的难点与重点之一。首都医科大学附属北京中医医院皮肤科经过多年研究提出血燥证病性为虚和毒[15]，血燥证患者热毒羁留体内，病久耗气伤血伤津，致阴血津液亏虚，肌肤失养，虚、毒共存，致皮损干燥，经久不消。正所谓“有诸内必形于外”。临床治疗以养血滋阴、润燥解毒为法，养血解毒方就是在此治法指导下形成的临床有效方剂。有研究发现，中药尤其补益药可通过恢复表皮屏障治疗疾病，因此，本研究旨在基于表皮屏障的调控分子紧密连接，阐释养血解毒方的组方科学性[16]。
课题组前期初步证实了养血解毒方对BALB/c小鼠银屑病样模型的干预作用[17]，因此本实验在前期研究的基础上，选取最佳药物剂量进行研究。与前期实验不同的是，本实验选用C57BL/6J小鼠予咪喹莫特进行模型构建。咪喹莫特可通过激活TLR受体通路出现类似临床银屑病的表现，普遍认为较符合银屑病血热证表现[18]，而咪喹莫特作用于C57BL/6J小鼠，相较作用于BALB/c小鼠品系，其炎症反应严重程度轻，疾病进展更为缓慢[19]，类似慢性炎症期反应。此外，C57BL/6J相较其他包括BALB/c在内的小鼠品系的给药表现与人类银屑病表现更为相近[20]。IL-17是银屑病皮损区的主要致炎因子，研究发现，IL-17可对紧密连接进行攻击，通过降低claudin-1，claudin-7，occludin蛋白的表达，破坏紧密连接的完整性[21]。因此，为了模拟银屑病发病的微环境，选用IL-17刺激角质形成细胞(Hacat细胞)作为模型进行研究，观察养血解毒方及其拆方组分直接对角质形成细胞紧密连接表达的影响。
本研究动物实验显示，养血解毒方可明显改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠皮损症状，降低PASI评分，增加小鼠表皮含水量，证实了其对受损表皮通透屏障的修复功能。病理结果提示，养血解毒方可显著降低表皮细胞的过度增殖及角化不全，并减少皮肤T淋巴细胞的激活浸润。进一步研究发现，养血解毒方可增加皮损区紧密连接蛋白claudin-1，claudin-7，occludin的表达并恢复其定位连续性，明确了养血解毒方对紧密连接的调节作用，并提示养血解毒方可能是通过调节紧密连接打破恶性循环，纠正异常的表皮细胞分化增殖过程，促进表皮通透屏障的恢复，从而缓解银屑病样皮损。结合体外实验直接观察养血解毒方不同组分对紧密连接的修复作用，研究发现，养血组分、解毒组分、养血解毒方全方对于IL-17诱导的角质形成细胞间紧密连接的破坏均有一定的恢复作用，但是养血组分在增加蛋白表达量、尤其是形成紧密连接的完整性上明显优于解毒组，养血组分和养血解毒方全方对紧密连接的修复无明显差异，提示养血解毒方中养血组分可直接作用于表皮细胞紧密连接，并对其进行调节。
综合以上研究结果，养血解毒方可通过调节银屑病皮损区表皮细胞紧密连接的表达恢复受损的皮肤屏障功能，打破“紧密连接失调—表皮细胞异常增殖分化—皮肤屏障功能受损—加重炎症—紧密连接进一步破坏”的恶性循环，改善表皮的修复环境，从而达到滋阴润燥、养血解毒的目的，实现银屑病的治疗效果。并且，修复被炎症因子破坏的表皮细胞间的紧密连接是该方养血组分的主要靶点。这可能是中医“养血润燥法”治疗银屑病的科学依据之一。
