微球是指药物溶解或分散在辅料中形成的微小球状实体。其粒径通常在0.01～300 μm。微球的粒径大小是否均匀，直接影响着其对不同靶器官血管口径的适应性。不仅如此，微球作为一种缓控释制剂，其粒径的大小是影响药物制剂质量的重要因素。笔者在药剂学实验中需要对一种微球的直径进行测量，以检验微球粒径的大小、均匀度是否符合注射剂的要求。传统的微球直径测量方法有正切机构式的微测力比较装置、显微计数法、电镜扫描法、激光粒度分析仪等[1-4]，前两种方法的操作较为复杂且精密度不高，而电镜扫描法、激光粒度分析仪成本较高，保养困难，不能满足基础实验室的需求。因此，找到一种简便、快捷的测量微球直径的方法尤其重要。故本研究选择三七总皂苷白蛋白作为研究对象，探究应用Photoshop软件测量微球直径的方法的可行性。
笔者在鉴定学实验中还发现Photoshop图像处理软件不仅可以应用于显微测量，还可以用于显微结构示意图的绘制。本研究选择三七药材粉末为研究对象，探究Photoshop在中药材显微鉴定中显微结构示意图的绘制方法的可行性。三七为五加科植物三七的干燥根和根茎[5]。由于三七价格较高，市场上流通和民间使用三七制成的三七粉时而有掺假销售的现象。三七粉末的伪品甚多，如白及、高良姜、姜黄、木薯等[6-9]均有人当作三七销售，这种掺假用药现象，不但影响了临床疗效，更为临床和民间用药安全埋下了巨大隐患。显微鉴定是常规的鉴定三七粉末真伪的方法之一，而显微结构图作为粉末显微鉴定的重要参考，其绘制的准确性十分重要。目前显微形态图的绘制多用手绘，绘制耗时长，难以真实准确地表现显微结构的形态。在现代科技发达的今天，将计算机辅助绘图技术融入单纯手工绘图中，不仅可以降低构图的难度和缩短绘图时间，形态更贴近原图。
总的来说，利用Photoshop软件不仅可以在显微观察时辅助微球直径测量，还有助于药材显微结构图的绘制，对中药学各学科今后的科研工作有所裨益。
1 Photoshop CS3测量微球直径
1.1 材料
C2型显微镜测微尺(网形目镜尺，上海宇隆仪器有限公司)；UB102i型光学显微镜(Biological microscope)；CS3以上版本Photoshop图形处理软件(Adobe公司)；数码相机(佳能株式会社，1 210万像素)。CTL-472型数位板(Wacom)。
三七总皂苷(PNS，西安源森生物科技有限公司，纯度80%)；牛血清白蛋白(BSA，上海鼓臣生物试剂有限公司，批号20170712002，纯度≥98%)；蓖麻油(西陇化工股份有限公司，批号20171202)；乙醚(国药团化学试剂有限公司，批号20160224)。
所有实验中药材均由作者购买于药店(同济堂药业、德昌祥药业、一品药业)，并由贵阳中医学院药学院的丁宁老师鉴定，凭证标本存放于贵阳中医学院制剂实验室。材料来源信息见表1。
| 编号 | 名称 | 拉丁名 | 产地 | 购买厂家 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 三七 | Panax notoginseng | 云南 | 贵州同济堂药业 |
| 2 | 三七 | P. notoginseng | 云南 | 贵州德昌祥药业 |
| 3 | 三七 | P. notoginseng | 云南 | 贵州一品药业 |
| 4 | 白芨 | Bletilla rchb | 贵州 | 贵州同济堂药业 |
| 5 | 高良姜 | Alpinia officinarum | 广西 | 贵州同济堂药业 |
| 6 | 姜黄 | Curcuma longa | 广西 | 贵州同济堂药业 |
| 7 | 木薯 | Manihot esculenta | 贵州 | 贵州同济堂药业 |
1.2 方法
1.2.1 三七总皂苷白蛋白微球的制备
取三七总皂苷(PNS)适量(约25 mg)，溶于1 mL蒸馏水中，加入牛血清白蛋白使解，然后逐滴加入到50 mL强力搅拌的蓖麻油中，加Span-80 2 mL，继续搅拌5 min，超声均化，得初乳。另取蓖麻油50 mL，加热至固化温度，搅拌下将初乳加入，恒温固化20 min，冷却，离心，倾去上层油液，再用适量乙醚洗涤3次，挥去乙醚，即得三七总皂苷白蛋白微球(PNS-BSA-MS)[10]。
1.2.2 拍摄微球图片
先用药匙取适量制备好的三七总皂苷白蛋白微球置于载玻片上，再用少量蒸馏水用解剖针将其分散均匀，盖上盖玻片，制备好装片后将其置于目镜中装有C2型网形目镜尺的光学显微镜中，放大100倍数下观察，用数码相机对准目镜聚焦拍摄多张照片。
1.2.3 对微球计数
用Photoshop CS3软件打开预先在光学显微镜下拍摄好的微球照片，选择“分析栏”项下“记数工具”选项并打钩，放大图片，在计数模式下点击鼠标标记出200个微球。见图1。
1.2.4 设置测量比例
选择“分析栏”项下“标尺工具”，见图2，在标尺工具状态下，测量C2型网形目镜尺1 000 μm的图像长度(鼠标点击目镜尺1 000 μm的“0”刻度的一端，再点击目镜尺1 000 μm的一端，通过分析栏的测量记录选项可以获取其长度值)，然后在选择分析栏“设置测量比例”项下“自定”项下“像素长度对应空格”中填入测得的像素长度，(本例中像素长度为295)下方的“逻辑长度对应空格”中填入1 000(所测目镜尺的实际长度)确定即可。见图3。
1.2.5 测量
最后对之前已计数的微球按顺序依次拖动鼠标进行测量(每个微球测量3次取平均值)，并选择“分析栏”——“测量记录”选项并打钩，每测一个微球就点一下“记录测量”，直到统计完200个微球的直径，见图4。测量完成后可将数据全部选中导出为TXT工作簿，然后把TXT工作簿里的内容复制到Excel文档中，选取“长度”数据列，复制到新的Excel文档中，再通过Excel软件自带的函数计算出200个微球的平均直径和标准偏差，并绘出直径分布图，见图5。PNS-BSA-MS微球直径均值为(30.62±4.21)μm，直径主要分布在20～40 μm。见表2。
| 直径范围/μm | 数量/个 | 占比/% | 直径( |
|---|---|---|---|
| 10～20 | 12 | 6.00 | 14.51±4.56 |
| 20～30 | 87 | 43.50 | 23.15±4.65 |
| 30～40 | 82 | 41.00 | 34.34±4.77 |
| 40～50 | 18 | 9.00 | 45.01±4.68 |
| 50～60 | 1 | 0.50 | 50.47±4.35 |
1.3 验证试验
为验证该方法的科学性，采用OLYMPUS BX41显微镜及激光粒度分析仪测量同一批微球粒径。
1.3.1 OLYMPUS BX41显微镜验证
应用OLYMPUS BX41显微镜，OLYMPUS DP72显像系统通过DP2-BSW软件对200个微球的数值进行测量，同时对选定的10个微球的直径进行测量，并与PS法进行对比。见表3，表4。结果发现2种方法所测量的相同10个微球的直径数值分别为34.80±6.97，34.96±7.97，非常接近，平均标准偏差为1.36%，表明2种方法测量的结果误差在一定范围内，没有显著性差异，说明Photoshop法测量微球直径的方法有效可行。
| 直径范围/μm | 数量/个 | 占比/% | 直径( |
|---|---|---|---|
| 10～20 | 13 | 6.5 | 14.52±3.26 |
| 20～30 | 85 | 42.5 | 14.67±4.41 |
| 30～40 | 80 | 40.0 | 15.01±4.57 |
| 40～50 | 20 | 10.0 | 15.24±4.32 |
| 50～60 | 2 | 1.0 | 15.30±4.15 |
| 编号 | Photoshop法 | DP2-BSW法 |
|---|---|---|
| 1 | 36.02 | 38.31 |
| 2 | 44.23 | 45.99 |
| 3 | 22.01 | 22.70 |
| 4 | 32.85 | 31.78 |
| 5 | 34.42 | 32.03 |
| 6 | 35.35 | 32.07 |
| 7 | 42.52 | 45.98 |
| 8 | 41.54 | 41.12 |
| 9 | 26.52 | 24.87 |
| 10 | 32.54 | 34.75 |
1.3.2 激光粒度分析仪验证
将样品配制成一定浓度的水溶液，加入到激光粒度分析仪样品池中，当光学浓度达到仪器最低浓度要求时，开始检测，得出聚合物微球直径及分布。激光粒度分析仪测出的微球平均直径为(30.18±4.67) μm，与Photoshop法所测量的数值非常接近，两组计量数据t检验结果表明两组微球粒径差异无统计学意义，说明Photoshop法测量微球直径的方法有效可行。
2 基于Photoshop图像处理软件对三七粉末显微特征图的绘制与鉴别
2.1 方法
粉末鉴别按照2015年版《中国药典》的取样方法[11]，将采集的7份样品分别打粉过6号筛。取少量粉末，稀甘油装片，中性树胶封片。将制作的装片置装有测微尺的光学显微镜下进行观察、拍照和描述。将显微图片用Photoshop软件打开，选取要绘制的显微结构，见图6A，“图像→调整→去色”，见图6B，“滤镜→风格化→查找边缘”功能对图片进行调整，新建图层用Wacom CTL-472数位板手绘，见图6C，最后新建白色背景图层即可。将所有绘好的显微特征图复制在新建的空白图层并制版，见图6D。
2.2 三七与其他4种伪品粉末显微特征描述
2.2.1 三七
本品粉末成灰黄色。淀粉粒多呈圆形、类圆形、半圆形、圆多角形单粒，脐点短缝状或三叉状、十字状，偏于一端或位于中部，层纹明显或隐约可见。见图7，图8。
2.2.2 白及
本品粉末成淡黄白色。含糊化淀粉粒的薄壁细胞多呈不规则碎块，偶见未糊化淀粉粒。黏液细胞甚大，类圆形或椭圆形，草酸钙针晶散在。见图7，图8。
2.2.3 高良姜
本品粉末呈棕色。淀粉粒肾形、长椭圆形、长卵形，脐点点状、短缝状或三叉状，偏于一端或位于中部，层纹不明显或隐约可见。见图7，图8。
2.2.4 姜黄
2.2.5 木薯
3 结论与讨论
Photoshop主要处理以像素所构成的数字图像，可以有效地进行图片编辑工作。随着版本不断地更新，Photoshop扩展的功能也越来越强大，不仅在设计、绘图、制图等领域上得到了广泛的运用，在农业、医学、鉴定、刑侦等领域也获得了越来越多的关注[12-17]。本实验采用光学显微镜结合数码拍摄，再应用Photoshop CS3以上版本的计数工具和标尺工具对三七总皂苷白蛋白微球(PNS-BSA-MS)的直径进行测量。此外，应用Photoshop CS3软件绘制三七及其4种常见伪品的显微特征结构示意图，有利于还原该组织结构的真实形态。
测微球直径中正切机构式的微测力比较装置测量球径有测量范围大、分辨力高、调校方法简单易掌握的特点，但此方法的测量精度易受周围环境(如震动，温度，尤其是气流抖动)的影响，对操作者的要求较高，目前这种方法，基本已经不再使用。显微计数法操作比较虽然比较简单，但因微球的数目过多，而且人眼疲劳容易造成漏数、错数、数混等情况，不适合一次性测量大批次微球的直径。电镜扫描法相对前两种方法来说快速简便，准确度也高，但因扫描电子显微镜耗材价格较贵，且仪器保养要求较高，不适合做工艺考察多批量测量微球直径，故应用并不广泛。还有一种激光粒度分析仪法应用较多，但有时检测后会出现多种波峰状态，部分粒度分布图中出现了双峰、多峰、宽峰等现象，检测结果差异大，给微球真实直径的判断造成困扰，且一旦样品池被污染，清洁非常麻烦。本文利用Photoshop软件标尺工具结合物镜测微尺测量微球直径的方法快速简便，且对设备要求不高，能满足基础实验室的需要，该方法不仅对微球的直径测量提供了一种行之有效的新方法，还可以举一反三运用到其他显微测量当中。适用于微球制备工艺优选等需要测量多批微球直径的实验，对微球直径测量可以提供一定的参考。
传统的显微形态绘图方法主要依靠徒手临摹草图及在硫酸纸上描摹，这种方法不仅费时费力，而且要具备较好的美术功底，因而绘制显微形态图对中药鉴定学工作者来说常是一件十分棘手的工作[18]。通过Photoshop绘制显微照片在一定程度上可以取代手工绘制显微形态墨线图，具有简便、快捷、形态逼真等特点[19]。本实验运用Photoshop软件绘制显微特征图能够使绘制的显微特征图形态相比传统手绘更贴近真实形态。
总之，随着Photoshop软件的深度开发和数码科技迅猛发展，其应用范围也越来越广泛，笔者将其应用在药学研究领域，既节约了研究成本、又提高了研究效率，为微球、微囊、脂质体等微小球体的粒径测量、为粉末显微结构示意图的绘制上提供了新的参考。
