我国是一个乙肝大国，由慢性乙型肝炎进展所形成的乙肝相关性慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)是肝衰竭的主要病因，而由免疫介导炎症反应所引起的肝功能损伤则是肝衰竭的主要发病机制。近年越来越多的研究发现，效应CD4＋T淋巴细胞作为肝衰竭特异性免疫细胞免疫应答中的重要部分则更是发挥着其关键作用[1]，其新亚群调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)在目前炎症反应调控相关研究中是热点[2-5]，与HBV-ACLF的发生进展关系密切。
依据肝衰竭自发病起以身目黄染为其主要症状，中医常把其归入“黄疸”，湖南中医药大学第一附属医院肝病研究所课题组在前瞻性病例研究中通过观察肝衰竭患者不同黄疸证的临床特点，提出了肝衰竭“阳黄-阴阳黄-阴黄”辨证论治模式，并逐渐优化形成以“阳黄-阴阳黄-阴黄”辨证论治模式为基本中医治疗肝衰竭的中西医结合治疗方案，且进一步证实其疗效[6-9]。但在HBV-ACLF背景下，关于黄疸不同证型的现代免疫学特点研究较少，主要集中在辅助性T细胞1(Th1)/辅助性T细胞2(Th2)，树突状细胞(DC)及相关细胞因子，最新研究发现Treg细胞/Th17细胞失衡在HBV-ACLF病变过程中发挥着免疫炎症调控的重要作用，与疾病进展及短期预后有很大关系，相关研究及本课题组前期研究均证实其机制[10-11]。因此本研究基于HBV-ACLF患者Treg/Th17细胞失衡，通过检测HBV-ACLF“阳黄-阴阳黄-阴黄”不同证候分型患者Treg/Th17细胞及其相关细胞因子表达，探讨肝衰竭不同中医证候分型的细胞免疫学特征，评价其对病情严重程度及中医辨证分型判断的临床意义，使中医辨证更加客观化，从而提高辨证准确率，以指导临床治疗。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年3月至2019年3月于湖南中医药大学第一附属医院肝病中心住院，入院西医诊断符合早期、中期、晚期HBV-ACLF患者各32例，共96例，男性72例，女性24例，平均年龄(47±19.87)岁。其中符合阳黄证33例(早期18例，中期12例，晚期3例)，阴阳黄证37例(早期14例，中期19例，晚期4例)，阴黄证26例(早期0例，中期1例，晚期25例)。各组在性别、年龄、民族、职业、饮酒、乙型肝炎病毒(HBV)感染史等临床基线特征差异无统计学意义，具有可比性。本研究经湖南中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准，批号伦审[2017]0720。入组患者签署知情同意书。
1.2 西医诊断标准
参照《肝衰竭诊治指南(2012年版)》[12]的诊断标准，在HBV感染相关的慢性肝病基础上，短期内发生急性或亚急性肝功能失代偿的临床症候群。早期，①有极度乏力，伴明显厌食、呕吐和腹胀等严重消化道症状；②黄疸进行性加深(血清总胆红素≥171 μmol·L-1或每日上升≥17.1 μmol·L-1)；③有出血倾向，30%<凝血酶原活动度(PTA)≤40%；④尚未出现肝性脑病或其他并发症。中期，病情在早期基础上，出现以下两条之一者，①出现Ⅱ度以下肝性脑病和(或)明显腹水、感染；②出血倾向明显(出血点或瘀斑)，20%<PTA≤30%。晚期，病情在中期基础上进一步加重，有严重出血倾向，PTA≤20%，并出现以下4条之一者：肝肾综合征，上消化道大出血，严重感染，Ⅱ度以上肝性脑病。
1.3 中医诊断标准
参照《中医内科学》[13]中关于黄疸的辨证标准，并结合“十一五”“十二五”传染病重大专项研究部分成果，对辨证标准进行适当调整，形成优化后的“阳黄-阴阳黄-阴黄”辨证论治标准。阳黄证主证为①身目黄色鲜明；②舌质红，或红绛，或兼见瘀斑瘀点；舌苔黄腻；③脉实有力或滑数。次证为①口干口苦，恶心呕吐；②大便秘结；③皮肤瘀斑，鼻齿衄血；④小便短少黄赤。阴阳黄证主证为①身目黄色晦暗或鲜明；②舌质淡红，或稍红，或兼见瘀斑瘀点，或伴舌边齿痕；舌苔白腻或厚腻或淡黄；③脉弦、或弦滑，或沉迟。次证为①腹胀便溏，恶心呕吐；②口不干，或口干不欲饮；③乏力，纳差。阴黄证主证为①身目黄色晦暗，或如烟熏；②舌质淡、苔白腻。次证为①痞闷腹胀，纳少乏力；②神疲畏寒；③口淡不渴；④脉沉迟或细缓。辨证要求为符合主证3项，或主证2项加次证2项。
1.4 排除标准
①乙肝相关性慢性肝病基础上合并其他病因如甲型肝炎病毒(HAV)，戊型肝炎病毒(HEV)，丙型肝炎病毒(HCV)，巨细胞病毒，及自身免疫性肝病，药物性肝损伤等导致的肝衰竭者；②合并有某些致死性并发症如脑水肿、食管静脉曲张破裂大出血等患者；③部分晚期患者已经实施肝移植术者；④任娠或哺乳期妇女；⑤合并原发性肝癌或其他肿瘤患者；⑥近3个月服用免疫抑制剂、激素的患者。
1.5 试剂
白细胞介素-17A(IL-17A)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，转化生长因子-β(TGF-β)，白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-23(IL-23)，CD4，CD25，CD3，IL-17A，叉状头(或)翅膀状螺旋转录因子(FoxP3)试剂盒(美国BD公司，货号分别为560383，560112，560429，558274，558245，555346，555432，560835，560486，560045)；trizol(Invitrogen公司，货号15596-026)；First Stand cDNA Synthesis Kit，SYBR Green PCR master mix(Promega公司，货号分别为K1612，TQ2300-02)；DNA Marker(MBI公司，货号E845-100RXN)；琼脂糖(Biowest公司，货号212272)。
1.6 仪器
C6型流式细胞仪(美国BD公司)；DHP-9052型37 ℃恒温培养箱(中国上海齐欣公司)；51119000 M ΜLTISKAN FC型酶标仪(美国Thermo公司)；MB-530型多功能酶标分析仪，PW-812型全自动酶标洗板机(中国汇松公司)；Sigma3-18K型冰冻变速离心机(美国Sigma公司)；UV2550型紫外分光光度仪(日本岛津公司)；ABI-7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；480型DNA热循环仪(美国Perkin Elmer公司)；DYCP-31C型电泳仪及转膜仪(中国北京六一仪器厂)。
1.7 观察指标
1.7.1 流式细胞仪检测外周血Treg，Th17细胞频数表达
Th17细胞检测，①取样，用肝素抗凝采血管采取入组患者外周血约2 mL，温室放置。②分离，人单核淋巴细胞分离液分离细胞，留细胞层250 μL。③细胞刺激活化，取100 μL以上制备的细胞层液体，加入RPMI 1640 150 μL和Cell Stimulation Cocktail 0.5 μL，混匀，37 ℃水浴箱中培养6 h。④细胞表面标记染色，向样品管中加入CD4抗体5 μL(其他抗体同步骤)，常温避光孵育20 min。⑤制备固定破膜剂和1×Perm/Wash Buffer。⑥固定破膜，重悬细胞，终体积在100 μL以内，每管加入固定破膜剂750 μL，常温避光孵育30 min。⑦胞内染色，每管加IL-17A抗体5 μL，混匀，室温避光孵育30 min；洗涤后留管底细胞层100 μL左右上机检测。Treg细胞检测，细胞表面标记染色，在上述步骤制备的100 μL细胞层样本于离心管中，加入表面染色的抗体CD4和CD25各5 μL，室温避光20 min。进行固定破膜。加FoxP3抗体5 μL胞内染色。洗涤后留管底细胞层100 μL左右上机检测。
1.7.2 流式细胞微球芯片捕获技术(CBA)检测IL-6，IL-10，TGF-β，IL-17A，IL-23水平
①用Assay Diluent 4 mL稀释对照品。②确定实验样本量，vertex充分涡旋每种捕获微球5～15 s，按照1 μL/样本确定实验中所需稀释的捕获微球总量，将每种捕获微球混匀于离心管中，加入检测因子稀释液3 920 μL，混匀，标记“混合捕获微球”，重悬微球，将混合好的捕获微球室温200 ×g离心5 min，取上清，加入“混合微球”相同体积容量的血清增强液，涡旋混匀，室温避光孵育30 min。③按照1 μL/样本确定试验中所需稀释的检测抗体总量，将每种检测混匀于离心管中，加入检测因子稀释液3 920 μL，混合均匀。④充分涡旋混匀已经重悬好的“混合微球”，每个实验管加入50 μL。避光室温孵育1 h。加入PE标记的细胞因子检测抗体50 μL到所有实验管中室温避光孵育2 h。洗涤样本，去上清，重悬细胞。上机检测。
1.7.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测外周血Treg/Th17细胞转录因子FoxP3，ROR-γt mRNA表达
①总RNA提取，采用trizol试剂提取总RNA。②cDNA合成，0.2 mL离心管中加入1 mg·L-1总RNA 2 μL，按照试剂盒说明进行逆转录反应。③引物设计与合成，引物由上海Sangon公司合成，见表1。④进行Real-time PCR反应，配置Real-time PCR反应体系：SYBR Green PCR Master Mix 12.0μL，上下游引物各1.0 μL, cDNA 1.0 μL。⑤加无菌去离子水补至20 μL，7500型荧光定量PCR仪进行PCR循环检测。以94 ℃，58 ℃，72 ℃，83 ℃各1 min(40个循环)进行扩增。数据采用仪器自带软件分析。以2-ΔΔCt表示mRNA相对表达。
| 引物 | 序列 | 长度/bp |
|---|---|---|
| FoxP3 | 上游5′-AAGAACGCCATCCGCCACAAC-3′ | 92 |
| 下游5′-TCCAGCTCATCCACGGTCCAC-3′ | ||
| ROR-γt | 上游5′-AGCGGCAACAGCAGCAACAG-3′ | 132 |
| 下游5′-CAGGCAGGTCAGGCGAGGAG-3′ | ||
| β-actin | 上游5′-GCACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′ | 93 |
| 下游5′-GCGGATGTCCACGTCACACTTC-3′ |
1.8 统计学方法
所有数据采用SPSS 20.0软件进行数据统计处理，计数资料以率或构成比表示，计量资料以
2 结果
2.1 HBV-ACLF患者不同分期中医证型分布特点
阳黄证主要分布在肝衰竭病程的早期(56%)和中期(37.5%)，以早期为主，阴阳黄证主要分布于早期(44%)和中期(59.37%)，以中期为主，阴黄证主要分布于晚期(78.12%)，见表2。
| 组别 | 阳黄证 | 阴阳黄证 | 阴黄证 |
|---|---|---|---|
| 早期 | 18(56.23) | 14(43.75) | 0 |
| 中期 | 12(37.5) | 19(59.38) | 1(3.13) |
| 晚期 | 3(9.38) | 4(12.5) | 25(78.13) |
2.2 HBV-ACLF患者不同中医证候分型Treg，Th17细胞频数表达比较
从阳黄证、阴阳黄证到阴黄证Treg，Th17细胞频数逐渐升高，各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表3。
| 组别 | n | Treg | Th17 |
|---|---|---|---|
| 阳黄 | 33 | 32.72±21.13 | 55.14±19.80 |
| 阴阳黄 | 37 | 46.72±20.231) | 60.98±19.071) |
| 阴黄 | 26 | 57.56±17.521，2) | 73.33±10.091，2) |
2.3 HBV-ACLF患者不同中医证候分型IL-17A，IL-23，TNF-α，TGF-β，IL-10表达比较
从阳黄证、阴阳黄证到阴黄证，Treg型细胞因子IL-10，TGF-β逐渐升高，各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，Th17型细胞因子IL-17A，TNF-α，IL-23逐渐升高，其中IL-17A阳黄组与阴黄组，阴阳黄组与阴黄组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，TNF-α，IL-23差异无统计学意义，见表4，表5。
| 组别 | n | IL-10 | TGF-β |
|---|---|---|---|
| 阳黄 | 33 | 18.38±18.38 | 55.49±28.02 |
| 阴阳黄 | 37 | 29.45±21.031) | 76.47±49.451) |
| 阴黄 | 26 | 53.24±76.641，2) | 106.54±69.491，2) |
| 组别 | n | TNF-α | IL-17A | IL-23 |
|---|---|---|---|---|
| 阳黄 | 33 | 2.59±0.91 | 2.43±1.06 | 3.46±1.59 |
| 阴阳黄 | 37 | 2.64±0.89 | 2.94±1.41 | 4.88±3.07 |
| 阴黄 | 26 | 3.19±1.28 | 5.15±3.891，2) | 7.51±12.1 |
2.4 HBV-ACLF患者不同中医证候分型FoxP3和ROR-γt mRNA表达与比较
从阳黄证、阴阳黄证到阴黄证，FoxP3表达逐渐下降，ROR-γt表达逐渐升高，FoxP3阳黄组与阴阳黄组比较，阳黄组与阴黄组比较差异有统计学意义(P<0.05)，ROR-γt各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6。
| 组别 | n | FoxP3 | ROR-γt |
|---|---|---|---|
| 阳黄 | 33 | 26.78±2.21 | 20.43±1.69 |
| 阴阳黄 | 37 | 23.24±1.981) | 23.97±2.021) |
| 阴黄 | 26 | 22.58±2.581) | 28.75±1.081，2) |
3 讨论
人体免疫功能强弱与中医正气盛衰、辨证分型存在相关性[14]，一方面表明免疫细胞表达水平及功能与中医“正气”有着密切关系，另一方面也说明了免疫调控是个基于免疫细胞、细胞因子、核转录因子等一体的复杂的网络，需要不断深入研究。《黄帝内经》曰：“阳气者，卫外而为固也”，免疫调节功能与中医“阳气”间的关系则更为相关，正常情况下，机体的免疫状态通过免疫调节机制而保持自身稳定，可认为是人体的“阳气”对人体起到了保护作用[15]。目前各个疾病关于中医证型的现代免疫学特点研究层出不穷，CD4＋ T淋巴细胞新亚群Treg/Th17细胞与中医证候分型的相关性研究在近几年也是研究热点。但在基于特异性细胞免疫学机制与中医证型的研究方面，关于肝脏相关性疾病尤其是肝衰竭阴、阳黄证的报道甚少。众多学者研究证实，阳黄证多处于疾病初期，病情较急，机体免疫功能亢进，肝组织炎症反应明显；阴黄证处于疾病后期，免疫功能进一步紊乱，免疫抵抗功能低下，但其机制及实质并未完全清楚。基于免疫调控进一步研究阴黄、阳黄实质，在肝衰竭辨证论治过程中从免疫指标水平的高低及Th17/Treg失衡偏移的方向初步判断患者的所处疾病的某一阶段，可以大致了解患者的中医分型倾向。
本课题组基于前期研究成果，研究HBV-ACLF患者外周血Treg/Th17细胞及其相关细胞因子动态表达，同时基于“阳黄-阴阳黄-阴黄”辨证论治模式，进一步研究其不同中医证候分型的细胞免疫学特征，发现HBV-ACLF早、中、晚期不同病程与中医证型的分布存在一定相关性，阳黄证主要分布在肝衰竭病程的早期，阴阳黄证主要分布于中期，阴黄证基本分布于晚期。免疫细胞Treg/Th17细胞及其部分相关细胞因子、特异性转录因子与肝衰竭中医辨证分型之间存在着相关性，肝衰竭发病后，病机以湿热与瘀热为主，证型主要分布在阳黄、阴阳黄，此时机体处于免疫亢进状态，免疫细胞激活分化亢进，同时存在Treg细胞相关因子IL-10，TGF-β上升，及Th17细胞相关因子IL-17A，TNF-α，IL-23上升，随着病程进展，正气消耗，脾虚失其健运，机体免疫逐渐下降，以阴黄为主证，Treg细胞特异性转录因子FoxP3 mRNA表达逐渐下降，而Th17细胞特异性转录因子ROR-γt mRNA表达逐渐升高，炎症因子过度释放，抗炎调节作用减弱，说明在肝衰竭辨证论治过程中依据Th17/Treg失衡偏移的方向及相关细胞因子的表达变化可初步判断患者的病期，大致了解患者的中医分型倾向，为中医黄疸辨证提供一个客观化实验指标提出了新思路，揭示中医药干预黄疸发挥免疫调节优势作用提供新靶点。
