2.1　动物分组及灌胃剂量

30只小鼠随机分为3组(每组10只)，即正常组，模型组和灵芝多糖组(剂量96 mg·kg^-1，经折算相当于2015年版《中国药典》中记载的人体临床生药有效量10 g)。灵芝多糖组小鼠灌胃给予灵芝多糖，正常组和模型组给予生理盐水，每天1次，给药体积均为0.02 mL·g^-1，连续14 d。给药7 d后2 h，除正常组外，模型组和灵芝多糖组均以X射线进行全身一次性照射(电子直线加速器对小鼠进行1次X射线全身照射，源皮距100 cm，剂量率2.0 J·kg^-1·min^-1，辐照剂量5.0 J·kg^-1)，照射后灵芝多糖组小鼠继续灌胃给予灵芝多糖，正常组和模型组继续给予生理盐水。

2.2　胸腺的采集与制备

于末次给药24 h后，取出的新鲜胸腺组织于4 ℃生理盐水中洗去浮血，滤纸吸干水分，剪取胸腺组织，在1 mL冰冷的甲醇-生理盐水(1∶9)混合液中低温匀浆，于4 ℃，4 000 r·min^-1离心15 min，取上清液100 μL，加入预冷至4 ℃的甲醇400 μL，旋涡混匀30 s，室温静置10 min，于4 ℃，13 000 r·min^-1离心15 min，取上清液并转移到微量进样管中，4 ℃冰箱放置待测。

2.3　代谢组学样本分析方法的建立

2.4　小鼠造模后的一般表现

正常组小鼠运动灵敏，毛色光泽，无松毛、掉毛等现象，也无死亡情况；模型组小鼠进食减少，体质量下降，毛色枯槁，易脱落，精神萎靡，行动缓慢；与模型组比较，灵芝多糖组小鼠毛色和精神状态等方面有所改善。与正常组比较，模型组小鼠免疫器官胸腺、脾脏产生了显著性萎缩，表明造模成功；灵芝多糖组小鼠的胸腺、脾脏指数明显高于模型组(P<0.05)，表明灵芝多糖能较好地促进免疫器官的恢复。见表1。

2.5　PCA轮廓分析

由质谱轮廓基峰强度(BPI)图谱可知，在正、负离子下各组小鼠胸腺组织代谢轮廓出现明显差异，见图1。PCA得分图结果显示，在正、负离子模式下，正常组和模型组样本分布区域基本分开，没有重叠的情况，表明小鼠辐射后胸腺代谢产物发生了明显变化，说明造模成功。灵芝多糖组、模型组与正常组小鼠胸腺代谢轮廓完全分开，说明各组样本的代谢物存在显著性差异，且灵芝多糖组处于正常组与模型组之间，说明其有一定的回调趋势，见图2，图3。

图1全屏查看

不同离子模式下各组小鼠胸腺组织的BPI

图2全屏查看

不同离子模式下正常组与模型组小鼠胸腺组织的3D-PCA

图3全屏查看

不同离子模式下3组小鼠胸腺组织的3D-PCA

2.6　OPLS-DA轮廓分析

对正、负离子的质谱代谢轮廓进行OPLS-DA，获得得分图，见图4。结果发现灵芝多糖组与正常组、模型组大致可区分，基本无交叉或重叠现象，说明模型拟合效果好；灵芝多糖组与模型组分开，且有向正常组靠近的趋势，说明与模型组的偏离情况相比，灵芝多糖组已有所改善，说明灵芝多糖对辐射损伤有明显的恢复效果。在正、负离子模式下的S-plot和VIP-plot中，选定VIP值>1且P≤0.05的离子为潜在的生物标志物，红色为选中的标志物，即变量高于聚类的平均水平，见图4，结果发现选取的标志物点差异较大。

图4全屏查看

不同离子模式下各组小鼠胸腺组织的OPLS-DA

2.7　生物标志物的鉴定

通过Progenesis QI和HMDB共鉴定出34个潜在生物标志物，经灵芝多糖干预后与模型组相比存在显著差异性，提示灵芝多糖的辐射防护作用可能与这些代谢标志物有关，见表2。结果发现灵芝多糖可显著上调模型组小鼠胸腺组织中20个代谢标志物表达水平，说明灵芝多糖对小鼠胸腺辐射损伤具有调节作用。

2.8　代谢标志物的生物信息分析

将表2中鉴定的34个生物标志物输入HMDB，得到化学结构、生物功能、细胞位置的信息，见图5。结果发现化学结构包括脂质、有机酸及其衍生物、有机杂环化合物等；在生物功能中参与了细胞信号、脂肪酸代谢、磷脂/甘油磷酸脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等；在细胞中主要存在于细胞外、细胞膜、细胞质。这些信息提示了标志物可能参与的机体主要生命活动，可推测药物可能的作用机制。

图5全屏查看

灵芝多糖对模型小鼠干预的潜在生物标志物分类

2.9　代谢通路分析

将34个潜在生物标志物进行通路显著富集分析，见图6和表3。结果找到潜在关键代谢通路为牛磺酸和亚牛磺酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢。

图6全屏查看

灵芝多糖对辐射损伤小鼠胸腺组织中潜在生物标记物的拓扑分析

3.1　牛磺酸和亚牛磺酸代谢

牛磺酸和牛磺胆酸都参与了牛磺酸和亚牛磺酸代谢，牛磺胆酸经水解生成牛磺酸，再经半胱氨酸氧化脱羧成亚牛磺酸，进一步氧化，参与牛磺酸和亚牛磺酸代谢。牛磺酸是淋巴细胞中含量最高的游离氨基酸，占淋巴细胞中自由氨基酸的50%。研究表明牛磺酸对细胞的保护作用机制主要是作为过氧化物清除剂，清除细胞内的自由基，从而减轻辐照对机体的损伤作用^[14]。此外，牛磺酸具有提高机体特异性和非特异性免疫功能的作用，缺乏牛磺酸会导致一系列免疫功能障碍。而胸腺作为机体的免疫器官，牛磺酸能不同程度的保护辐照后的淋巴细胞，进而改善辐照对免疫功能的损伤作用^[15]。与正常组比较，牛磺酸在模型组中的表达水平有所下降，推测电离辐射通过抑制牛磺胆酸水解为牛磺酸的水平进而降低牛磺酸的含量，使机体造成免疫损伤；与模型组比较，牛磺酸在灵芝多糖组显著上调，说明灵芝多糖可能通过干预牛磺酸和亚牛磺酸代谢中牛磺酸的合成从而改善机体免疫系统异常。

3.2　D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢

L-谷氨酸参与了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及通路相关性较强的D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。在胞质中，谷氨酰胺贡献其γ(酰胺)氮来合成核苷酸和己糖胺，从而在这个过程中产生谷氨酸。胞质谷氨酸对维持氧化还原反应平衡并通过产生谷胱甘肽来避免细胞出现氧化应激非常关键^[16]。本文研究表明，与空白组相比，模型组L-谷氨酸的含量显著降低，原因是受辐射损伤后机体处于应激或病理状态下，内源合成的谷氨酰胺大量消耗，对谷氨酰胺的需求量增大，导致谷氨酸合成受到抑制，进而抑制谷胱甘肽含量，使机体中自由基含量增多，免疫功能发生损伤。谷氨酰胺是免疫细胞快速生长和分化细胞的主要能源物质，其水平的变化会使免疫功能发生改变。谷氨酰胺可促进还原性谷胱甘肽的合成来对抗体内的自由基，同时对免疫细胞也有一定的防护作用^[17]。而在本研究中发现，灵芝多糖组与模型组相比，L-谷氨酸含量明显回升，提示灵芝多糖可以减缓辐射对机体造成的损伤，进一步证实灵芝多糖可通过调节D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢中L-谷氨酸的含量来实现改善辐射损伤。

3.3　甘油磷脂代谢

PC[18∶1(11Z)/18∶1(9Z)]和PC[14∶0/20∶1(11Z)]是磷脂酰胆碱，主要参与甘油磷脂代谢，还参与花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢，由胆碱途径、乙醇胺途径和磷脂酰丝氨酸(PS)途径3种途径合成^[18]。磷脂酰胆碱具有极性和非极性部分，从而插入自身细胞膜，防止脂质过氧化，抑制脂质二硫键的断裂，防止细胞被破坏凋亡^[19-20]，保持其细胞的完整性。与模型组相比，灵芝多糖组的PC[18∶1(11Z)/18∶1(9Z)]和PC[14∶0/20∶1(11Z)]显著上调，推测通过上调磷脂酰胆碱来抑制电离射线造成的细胞损伤，保存细胞的完整性，有利于对电离辐射损伤的防护。

LysoPC(P-18∶0)，LysoPC(18∶0)，LysoPC[20∶2(11Z，14Z)]，LysoPC[18∶1(9Z)]，LysoPC[20∶3(5Z，8Z，11Z)]，LysoPC[16∶1(9Z)]都参与甘油磷脂代谢，是单甘油磷脂，一般称为溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱是通过磷脂酶A2水解磷脂酰胆碱形成的，具有较强的表面活性剂，溶血磷脂酰胆碱含量过高，可以使组织细胞发生溶血或坏死，使机体造成损伤，免疫系统功能发生紊乱。与正常组比较，模型组中LysoPC(P-18∶0)，LysoPC(18∶0)，LysoPC[18∶1(9Z)]，LysoPC[20∶3(5Z，8Z，11Z)]，LysoPC[16∶1(9Z)]均上调，给予灵芝多糖后其表达水平显著下调，与正常组接近。推测通过抑制磷脂酶A2水解磷脂酰胆碱达到小鼠抗电离辐射的作用，说明灵芝多糖对细胞溶血及坏死有一定的保护作用。

3.4　总结

辐射损伤的发生以脂类代谢、氨基酸代谢及能量代谢的紊乱为主，其中牛磺酸和亚牛磺酸代谢，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，甘油磷脂代谢相关性最强，使整个机体机能处于一种失衡状态。本研究结果表明内源性代谢物的变化不仅能反映出辐射损伤小鼠体内发生的生理变化，而且能在一定程度上反映灵芝多糖干预后出现的明显回调情况，这一结果与灵芝多糖能够改善胸腺免疫组织状态、减轻辐射损伤效果一致。这些结果提示灵芝多糖抗电离辐射的作用可通过胸腺中多个代谢物靶点的干预来实现，也再次证实代谢组学技术能从整体上解释机体应激状态或揭示机体接受治疗后表现出的生物学特征，更加全面了解机体辐射后的代谢过程和代谢产物，可为辐射损伤的诊断以及辐射防护药物的研制提供实验依据。但是辐射代谢组学的研究还主要集中在动物和细胞水平，随着研究的深入及新技术的出现，可以预测代谢组学技术将在辐射损伤的机制及其防治药物研究中发挥更大作用。