经典名方是指目前仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的清代及清代以前医籍所记载的方剂，是目前我国中药创新药物开发研究的热点之一[1]。2019年3月22日国家药品监督管理局发布了“古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求”(征求意见稿)，要求“提供不同批次饮片制备及同批次饮片制备的多批次对应实物的质量研究资料”，明确经典名方物质基准的关键质量属性。经典名方虽然免临床研究，但从研发和注册审评的角度，其在质量控制和评价方面要求甚高[2]。因此，开展经典名方物质基准质量控制的研究，建立能全面反映经典名方化学质量概貌的质量控制标准，对于其复方制剂的研究和申报显得尤为重要。
身痛逐瘀汤出自清·王清任的《医林改错》，具活血祛瘀、祛风除湿、通痹止痛之功，主治瘀血闭阻经络所致肩臂痛、腰腿痛或周身疼痛、经久不愈者[3]，临床常用于风湿性关节炎、骨性关节炎、颈椎病、肩周炎、腰椎间盘突出、坐骨神经痛等疾病的治疗[4-5]。该方由12味药物组成，方中桃仁、红花活血祛瘀，当归、川芎、没药、五灵脂、地龙、牛膝、香附合用以活血理气、通络止痛、利关节，羌活、秦艽同用可祛风寒湿邪，甘草药性缓和、调和诸药[6]；被收载于2018年国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录(第一批)》中。本课题组前期已对身痛逐瘀汤物质基准的制备工艺进行了考察，亟需对其物质基准建立一种专属性强、可反映处方质量整体的质量控制方法。经过分析后发现，身痛逐瘀汤中可测的主要成分有绿原酸、龙胆苦苷、马钱苷酸(源自秦艽)，阿魏酸(源自川芎和当归)，苦杏仁苷(源自桃仁)，羟基红花黄色素A(源自红花)，甘草苷(源自甘草)，肌苷(源自地龙)8种，但这8种成分的最大吸收均在不同波长处，难以保证在最大吸收波长处检测所有成分，以免影响峰值响应和检测结果稳定性。
为了准确测定身痛逐瘀汤物质基准样品中多成分含量，本实验采用多成分指标结合HPLC波长切换法[7-9]，用于方中绿原酸、龙胆苦苷、马钱苷酸等8种成分的含量测定，保证多成分在最大吸收波长下的最佳吸收而互不干扰；同时结合正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等化学模式识别方法，评价各批次样品含量测定结果的差异，为确定多批次身痛逐瘀汤物质基准的关键质量属性提供实验依据。
1 材料
UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)。肌苷(批号wkq16090505)，马钱苷酸(批号wkq18011103)，绿原酸(批号wkq18022809)，苦杏仁苷(批号wkq16072002)，羟基红花黄色素A(批号wkq18010407)，龙胆苦苷(批号wkq18051602)，阿魏酸(批号wkq15121602)，甘草苷(批号wkq16071504)对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%；水为纯化水，乙腈、磷酸为色谱级，其他试剂均为分析纯。身痛逐瘀汤中11种饮片(秦艽、川芎、桃仁等)的15批样品均购于安徽亳州药材市场，没药的15批样品均购于浙江森虹医药有限公司，饮片产地信息见表1；经成都中医药大学卢先明教授鉴定，各饮片均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下的规定。
| 饮片 | 产地 | ||
|---|---|---|---|
| 批次1～5 | 批次6～10 | 批次11～15 | |
| 秦艽 | 云南永善 | 内蒙古宁城 | 甘肃陇西 |
| 川芎 | 四川都江堰 | 云南鹤庆 | 甘肃华亭 |
| 桃仁 | 山西朔州 | 河北张家口 | 山西大同 |
| 红花 | 甘肃玉门 | 云南永善 | 新疆吉木萨 |
| 甘草 | 宁夏利通区 | 内蒙古松山区 | 甘肃民勤县 |
| 羌活 | 甘肃合作 | 四川黑水 | 青海互助 |
| 当归 | 云南师宗 | 青海大通 | 甘肃岷县 |
| 五灵脂 | 陕西商州 | 湖北郧西 | 广西金城江 |
| 香附 | 广东城月 | 广东界炮 | 广东岭北 |
| 牛膝 | 河南温县 | 河南孟州 | 河南武陟 |
| 地龙 | 广西河甫 | 广西博白 | 广西陆川 |
| 没药 | 埃塞俄比亚 | 埃塞俄比亚 | 埃塞俄比亚 |
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0～15 min，5%～13%A；15～27 min，13%～19%A；27～32 min，19%A；32～40 min，19%～25%A；40～45 min，25%～37%A；45～54 min，37%A)，柱温25 ℃，流速1 mL·min-1，进样量10 μL；检测波长分别为248 nm(0～11 min，检测肌苷)，235 nm(11～14 min，检测马钱苷酸)，324 nm(14～16 min，检测绿原酸)，220 nm(16～19 min，检测苦杏仁苷、羟基红花黄色素A)，274 nm(19～26 min，检测龙胆苦苷)，247 nm(26～54 min，检测阿魏酸、甘草苷)。
2.2 溶液的配制
2.2.1 混合对照品溶液
精密称取肌苷对照品适量，加水定容至10 mL，得672 mg·L-1对照品储备液；精密称取马钱苷酸、苦杏仁苷、龙胆苦苷对照品适量，分别加甲醇定容至10 mL，得质量浓度依次为580，1 112，1 132 mg·L-1的对照品储备液；精密称取绿原酸，羟基红花黄色素A，阿魏酸，甘草苷对照品适量，分别加70%甲醇定容至10 mL，得质量浓度依次为620，1 352，1 136，1 240 mg·L-1的对照品储备液。分别精密量取上述8种对照品储备液适量，置于同一10 mL量瓶中，制成肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷质量浓度依次为67.2，58，62，166.8，270.4，226.4，56.8，124 mg·L-1的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液
按照国家公布的《古代经典名方目录(第一批)》中身痛逐瘀汤的处方组成及清代剂量换算(一钱＝3.73 g)[10]，即秦艽3.73 g，川芎7.46 g，桃仁11.19 g，红花11.19 g，甘草7.46 g，羌活3.73 g，没药7.46 g，当归11.19 g，灵脂(炒)7.46 g，香附3.73 g，牛膝11.19 g，地龙(去土)7.46 g。基于古法记载，结合本课题组前期工艺研究，称取全方饮片量约93.25 g，浸泡30 min，加8倍量水煎煮30 min，纱布过滤，将滤液减压浓缩至200 mL，冷冻干燥成粉末。精密称取冻干粉约0.2 g，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性样品溶液
按照2.2.2项下供试品溶液制备方法，分别制备缺地龙、缺秦艽、缺桃仁、缺红花、缺川芎和当归、缺甘草的阴性样品溶液。
2.3 系统适应性试验
按照2.1项下色谱条件测定混合对照品溶液、供试品溶液和6种阴性样品溶液，结果表明样品中各成分均能达到基线分离，分离度和理论板数均较好，且阴性无干扰；但缺川芎和当归阴性样品中7号峰(阿魏酸)不具备专属性，且该色谱峰的峰面积较全方及其他阴性样品低。见图1。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察
取2.2.1项下混合对照品溶液，分别稀释0，2，4，8，16，32倍，按照2.1项下色谱条件进行测定。以各成分对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得各成分回归方程，见表2。
| 成分 | 回归方程 | r | 线性范围/mg·L-1 |
|---|---|---|---|
| 肌苷 | Y＝0.213 4X-0.055 5 | 0.999 8 | 2.1～67.2 |
| 马钱苷酸 | Y＝0.246 3X＋0.019 3 | 0.999 9 | 1.812 5～58 |
| 绿原酸 | Y＝0.468 3X-0.358 8 | 0.999 9 | 1.937 5～62 |
| 苦杏仁苷 | Y＝0.074 5X＋0.048 6 | 0.999 9 | 5.212 5～166.8 |
| 羟基红花黄色素A | Y＝0.119 7X-0.747 0 | 0.999 6 | 8.45～270.4 |
| 龙胆苦苷 | Y＝0.223 3X＋0.243 4 | 0.999 9 | 7.075～226.4 |
| 阿魏酸 | Y＝0.456 9X-0.051 7 | 0.999 9 | 1.775～56.8 |
| 甘草苷 | Y＝0.105 4X＋0.050 2 | 0.999 9 | 3.875～124 |
2.4.2 精密度试验
取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，计算肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷峰面积的RSD分别为0.4%，0.3%，0.5%，0.7%，0.2%，0.1%，1.0%，0.7%，表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验
同一批次样品(批次6)，按2.2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，按2.1项下条件测定，结果肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷的平均质量分数分别为0.223 9，0.186 2，0.099 2，1.021 4，2.126，2.016，0.127 2，0.263 8 mg·g-1，RSD依次为0.6%，0.2%，0.3%，0.6%，0.2%，0.1%，0.9%和0.7%，表明该方法重复性良好。
2.4.4 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于制备后0，2，4，8，12，24 h按2.1项下色谱条件测定，结果肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷峰面积的RSD分别为0.5%，0.3%，0.4%，0.7%，0.2%，0.1%，0.9%和0.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.5 加样回收率试验
精密量取已知8种指标成分含量的身痛逐瘀汤物质基准冻干粉约0.2 g，置10 mL量瓶中，精密加入一定量对照品(肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷质量分别为0.211 3，0.169 7，0.089 7，0.936 5，1.975 3，1.863 2，0.112 0，0.251 1 mg)，平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算各指标成分的回收率。结果肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷的平均加样回收率分别为99.23%，100.09%，99.33%，98.85%，99.15%，98.75%，99.42%，98.96%；RSD分别为0.5%，1.2%，1.0%，1.2%，1.4%，1.1%，0.9%，0.7%。表明该方法准确可靠。
2.5 样品测定
称取15批饮片样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，采用外标一点法进行计算，见表3。
| 样品 | 肌苷 | 马钱苷酸 | 绿原酸 | 苦杏仁苷 | 羟基红花黄色素A | 龙胆苦苷 | 阿魏酸 | 甘草苷 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| S1 | 0.202 9 | 0.179 0 | 0.073 3 | 1.458 2 | 2.444 7 | 0.992 7 | 0.089 1 | 0.516 4 |
| S2 | 0.224 5 | 0.219 0 | 0.101 7 | 1.438 2 | 2.400 7 | 1.070 7 | 0.118 2 | 0.564 2 |
| S3 | 0.215 5 | 0.176 1 | 0.168 0 | 0.989 2 | 2.232 0 | 1.375 1 | 0.107 9 | 0.421 3 |
| S4 | 0.250 3 | 0.217 4 | 0.085 4 | 1.371 3 | 2.553 3 | 1.085 2 | 0.104 2 | 0.704 3 |
| S5 | 0.216 9 | 0.187 1 | 0.086 0 | 1.119 1 | 2.249 7 | 0.933 3 | 0.143 4 | 0.212 5 |
| S6 | 0.225 8 | 0.183 5 | 0.096 2 | 1.004 5 | 2.119 2 | 1.997 5 | 0.120 0 | 0.269 5 |
| S7 | 0.239 3 | 0.221 2 | 0.104 5 | 0.968 4 | 1.905 4 | 1.734 7 | 0.118 0 | 0.376 0 |
| S8 | 0.183 5 | 0.233 5 | 0.169 8 | 0.959 2 | 2.088 2 | 1.832 2 | 0.138 6 | 0.278 7 |
| S9 | 0.185 6 | 0.252 8 | 0.101 0 | 1.000 0 | 1.978 3 | 1.974 4 | 0.117 7 | 0.282 5 |
| S10 | 0.221 1 | 0.265 3 | 0.109 9 | 1.074 5 | 2.083 2 | 1.802 1 | 0.105 5 | 0.390 2 |
| S11 | 0.204 9 | 0.219 4 | 0.087 3 | 1.243 0 | 2.485 2 | 1.316 2 | 0.084 6 | 0.278 3 |
| S12 | 0.206 1 | 0.175 5 | 0.069 5 | 1.131 6 | 2.341 6 | 1.395 1 | 0.086 1 | 0.330 2 |
| S13 | 0.207 6 | 0.213 4 | 0.072 8 | 1.261 2 | 2.169 3 | 1.399 4 | 0.087 2 | 0.393 9 |
| S14 | 0.204 0 | 0.181 1 | 0.081 8 | 1.317 4 | 2.293 3 | 1.002 0 | 0.105 7 | 0.410 6 |
| S15 | 0.223 6 | 0.173 1 | 0.094 8 | 0.961 3 | 2.545 9 | 1.272 4 | 0.085 5 | 0.312 8 |
由表3可知，15批身痛逐瘀汤物质基准冻干粉中肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，甘草苷质量分数分别为0.183 5～0.250 3，0.173 1～0.265 3，0.069 5～0.169 8，0.959 2～1.458 2，1.905 4～2.553 3，0.933 3～1.997 5，0.084 6～0.143 4，0.212 5～0.704 3 mg·g-1。
2.6 OPLS-DA处理
为了更好地分析不同产地样品之间的成分含量差异，采用有监督的OPLS-DA模型进行分析[11-15]。以样品S1～S15为Y变量，8种成分的含量为X变量，利用SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA处理，见图2，图3，图4。结果发现在置信区间(95%)内，15批样品存在一定差异性，根据分布可将样品S1～S15分为3类，样品S3，S5，S6～S10为Ⅰ类，样品S2和S4为Ⅱ类，样品S1，S11～S15为Ⅲ类；对样品分类贡献较大[变量重要性投影(VIP)值>1]的有4种成分，依次为甘草苷、阿魏酸、龙胆苦苷和羟基红花黄色素A，说明这4种成分是影响不同批次样品之间质量差异贡献较大的成分。
3 讨论
3.1 测定指标确定
依据2015年版《中国药典》对身痛逐瘀汤所含12味饮片中含量测定的法定指标成分[16]以及相关文献资料，确定了该方物质基准质量评价的指标性成分，采用HPLC波长切换法测定这些成分的含量。绿原酸具有抗骨质疏松作用，可促进大鼠成骨细胞增殖[17]；杯苋甾酮具有抗骨质疏松等作用[18]；肌苷具有抗关节痹痛等活性[19]；阿魏酸具有抗炎止痛、抗血小板凝聚等活性[20]；羟基红花黄色素A联合苦杏仁苷可缓解椎间盘退变[21]；龙胆苦苷、马钱苷酸等环烯醚萜类具有抗炎镇痛等活性，可用于治疗风湿性关节炎[22]；甘草苷具有神经保护和治疗心血管系统疾病等活性[23]。预试验同时测定了秦艽(龙胆苦苷、马钱苷酸)，川芎和当归(阿魏酸)，桃仁(苦杏仁苷)，红花(羟基红花黄色素A)，甘草(甘草苷、甘草酸)，羌活(羌活醇、异欧前胡素)，香附(α-香附酮)，牛膝(β-蜕皮甾酮、杯苋甾酮)，地龙(肌苷、尿苷)中各成分含量，结果发现绿原酸，龙胆苦苷，马钱苷酸，阿魏酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，甘草苷，肌苷8种成分含量较高，其他成分含量均较低，不具有代表意义。因此，选择以上8种与药效相关联的化学成分共同控制身痛逐瘀汤的质量，可为其他经典名方物质基准及制剂质量的评价提供参考。
3.2 供试品提取溶剂和流动相的选择
供试品溶液制备时分别考察了水和不同体积分数(25%，50%，70%，100%)甲醇对物质基准中有效成分的影响，综合考虑各待测成分的色谱峰峰形及分离度，最终选择70%甲醇为提取溶剂。流动相系统分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.5%乙酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等，结果表明乙腈-0.1%磷酸水溶液在色谱峰峰形、分离度及出峰数量等方面较优。
3.3 检测波长的选择
身痛逐瘀汤所含药味众多、化学成分复杂，由于待测10种指标成分具有不同的最大吸收波长，同一检测波长难以保证每个成分的最佳吸收，进而会影响测定结果，故本实验采用波长切换法进行测定[8]。采用DAD在190～400 nm处对10种成分进行全扫描，结果显示肌苷，马钱苷酸，绿原酸，苦杏仁苷，羟基红花黄色素A，龙胆苦苷，阿魏酸，β-蜕皮甾酮，甘草苷，杯苋甾酮的最大吸收波长分别为248，235，324，210，226，274，322，247，276，247 nm。结合HPLC色谱图，最终设定各指标成分的检测波长为248 nm(肌苷)，235 nm(马钱苷酸)，324 nm(绿原酸)，220 nm(苦杏仁苷、羟基红花黄色素A)，274 nm(龙胆苦苷)，247 nm(阿魏酸、甘草苷、杯苋甾酮和β-蜕皮甾酮)；但β-蜕皮甾酮和杯苋甾酮的含量低，且仅存在于部分批次样品中，故未作为指标成分。
3.4 测定结果分析
同批身痛逐瘀汤物质基准中羟基红花黄色素A和龙胆苦苷、苦杏仁苷的含量相对较高，通过对样品进行OPLS-DA处理，结果发现15批身痛逐瘀汤物质基准在一些主要成分的含量上存在差异，其中甘草苷(源自甘草)，阿魏酸(主要源自川芎、当归)，龙胆苦苷(源自秦艽)以及羟基红花黄色素A(源自红花)是区分不同批次样品质量的关键成分，但导致含量差异的主要因素可能是复方中各单味药的剂量不同和有效成分的水溶性不同。因此，提高身痛逐瘀汤质量的首要任务是重点控制上述4种成分的含量，可通过优选源于道地产区或者主产区的药材，减少批次间的质量差异，这对于提高身痛逐瘀汤物质基准的质量一致性具有重要意义。同时，这也为确定经典名方物质基准及复方制剂的关键质量属性提供了依据，有利于建立中药质量控制溯源体系并保证质量控制的均一性。
