金黄色葡萄球菌(SA)是一种常在鼻前庭定植的病原菌，亦可见于鼻外定植，如皮肤、会阴、胃肠道和喉部。SA病菌可通过多种途径侵入机体，引起造成局部组织、内脏器官或全身性化脓性感染。研究调查结果显示，约30%成年人鼻前庭有SA定植[1]。从1961年报道了第一株MRSA病菌，即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillm-resistant Staphylococcus aureus)以来，SA和MRSA的检出率呈逐年上升趋势，MRSA感染已成为近年来医学上的一个难题[2-3]。一项流行病学研究显示，美国的SA的感染每年造成约1.9万人死亡，其中金黄色葡萄球菌肺炎(SAP)在儿科中较常见[1，3]。目前糖肽类、恶唑烷酮类抗生素仍是SA感染重症患儿治疗最有效的首选药物，在临床上被大量使用甚至滥用，继而造成进展迅速的耐药问题也令人堪忧[4]。
大量的研究报道表明具有清热解毒的中药及其组方，例如黄柏、黄连片、黄芩片、清金颗粒、连花清瘟胶囊等对于MRSA具有显著的抗菌作用[5-10]。柴葛芩连汤出自《症因脉治》卷四，该方为古典清热方剂，由北柴胡、葛根、黄芩片和黄连片经过煎煮熬制而成。柴葛芩连汤具有清热，升阳以止利的功效，主治外感中热泻，发热口渴，唇干齿燥，面赤烦躁，小便赤涩，小腹中一泛即泻，一泻即止，少顷复痛复泻，肛门灼热，粪色多黄，热在表者[11]。现代研究报道表明柴葛芩连汤临床单用或者联合抗生素治疗小儿支气管肺炎湿热闭肺证等炎症性疾病具有良好的效果[12-14]。但其治疗肺炎的药效机制尚未清楚，本研究应用幼鼠肺炎模型，探讨出自《症因脉治》的柴葛芩连汤对MRSA的治疗作用及其机制。
1 材料
1.1 动物
健康雄性C57BL/6J幼年小鼠(幼鼠)200只，SPF级，年龄4～6周，购自河南省实验动物生产有限公司，合格证号SCXY(豫)2012-0002。室内环境控制在12 h/12 h黑白交替，温度(23±2) ℃，湿度55%±5%。动物实验经河南中医药大学医学伦理委员会批准(201805081)。
1.2 药物
柴葛芩连汤(北柴胡l0 g，黄芩片10 g，葛根10 g，甘草片6 g，黄连片2 g，由本校药学院提供，以上药物均由河南省中医院药学部伏晓主任进行鉴定)。中药煎煮前用冷水浸泡20 min，煎煮20 min，煎煮2次，最后浓缩成19 mL，质量浓度为2 g·mL-1，给药剂量为高剂量200 mg·kg-1，低剂量100 mg·kg-1[15]。
1.3 试剂
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC4300(美国ATCC公司，批号ATCC4300)；克林霉素(美国Selleck公司，批号S2555)；trizol(美国Therm Fisher公司，批号15596026)；苏木素染色液(美国Sigma公司，货号517-28-2)；伊红染色液(武汉博士德生物工程有限公司，货号AR1180-2)；小鼠白细胞介素-16(IL-16)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(美国Biolegend公司，批号分别为XYA062Ra，430904)；鼠抗人肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-7(Caspase-7)，Caspase-3，β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体，兔抗鼠二抗(美国Abcam公司，批号分别为ab19139，ab255818，ab13585，ab8227，ab97046))；cDNA第一链合成试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，批号KGA1313)；实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR) Master Mix(SYBR Green)(日本Toyobo公司，批号QPK201)。
1.4 仪器
DP72型显微镜(日本Olympus公司)；MultiGene Gradient型PCR循环仪(日本岛津公司)，DA7600型Real-time PCR循环仪(中山达安公司)；Centrifuge 5810R型低温高速离心机，5333型梯度PCR仪，Lightrcycler型Real-time PCR仪(德国Roche公司)；EPS-300型电泳仪，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白电泳槽，Mini Trans-Blot型蛋白转印系统，ChemiDoc™ XRS＋型化学发光凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；ZS-2型板式酶标仪(北京市新风机电技术公司)。
2 方法
2.1 模型建立及分组给药[16]
幼鼠适应1周后用于建立MRSA肺炎小鼠模型。ATCC4300是MRSA的标准菌株，将ATCC4300菌液10 μL(1×1010 CFU·mL-1)经幼鼠鼻孔缓慢滴入幼鼠鼻腔内建立肺炎幼鼠模型。造模幼鼠200只，随机分为模型组、克林霉素组和柴葛芩连汤高、低剂量组，每组50只。另外随机选取正常C57BL/6J小鼠40只，经鼻孔缓慢将生理盐水滴入幼鼠鼻腔中，作为假手术组。克林霉素组作为阳性药组，幼鼠给与腹腔注射克林霉素120 mg·kg-1。柴葛芩连汤组幼鼠灌胃给予对应剂量的柴葛芩连汤。假手术组作为阴性组给予等量生理盐水。
2.2 菌落计数
在给药5 d后对每组随机选取部分幼鼠颈椎脱臼处死，在无菌操作下取出部分肺脏，称质量、组织匀浆、稀释，固定于培养基表层，恒温箱培养中培养24 h后于显微镜下进行菌落计数；另一部分肺脏用于苏木素-伊红(HE)染色。
2.3 HE染色观察大鼠脑组织形态学变化
取肺组织置于10%甲醛溶液中固定，进行常规石蜡切片，厚度为4 μm，HE染色，中性树胶封片后于光学显微镜下观察大鼠脑组织形态学变化。
2.4 ELISA检测IL-16，TNF-α含量
在给药5 d后，每组随机选取部分幼鼠麻醉后，运用ELISA试剂盒方法对肺泡灌洗液中IL-16，TNF-α含量进行测定。
2.5 Real-time PCR检测TNFR1，Caspase-3，Caspase-7 mRNA表达
在给药5 d后，每组随机选取部分鼠颈椎脱臼处死，在无菌操作下取出部分肺脏研磨后，加入trizol进行裂解，采用RNA提取试剂盒分离提取肺中的总mRNA。测定总mRNA浓度，符合要求后，采用cDNA合成试剂盒合成模板cDNA并进行逆转录PCR(RT-PCR)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，RT-PCR引物序列，TNFR1(1.4 kbp)：上游5′-CATTGCCTAGCGAG CGACG-3′，下游5′-GGTAGGCTTCGGGAGACC-3′；Caspase-3 (834 bp)；上游5′-TGGAACAAATG GACCTGTTGACC-3′，下游5′-AGGACTCAAATTCTG TTGCCACC-3′；Caspase-7(488 bp)；上游5′-TCCACCCGGCACTACAATCT-3′，下游5′-CCATCAC CGACCATCAGACCTGG-3′；β-actin(136 bp)上游5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，下游5′-TGGA AATTGTGAGGGAGATGC-3′。Real-time PCR扩增仪检测mRNA表达水平。Real-time PCR扩增体系为10 μL,反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，进行35个循环。采用2-ΔΔCt方法表示mRNA相对表达量。运用7500 system software系统分析结果，得出各组β-actin和目的基因的Ct值，相对定量采用2-ΔΔCt分析方法，假定目的基因与β-actin的相对表达量为1，计算目的基因的表达量，以此表示目的基因相对表达量。
2.6 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TNFR1，Caspase-3，Caspase-7蛋白表达
在给药5 d后，每组随机选取部分幼鼠颈椎脱臼处死，在无菌操作下取出肺脏组织于蛋白裂解缓冲液中匀浆，分离提取各个幼鼠肺总蛋白。蛋白于SDS-PAGE胶上进行电泳分离并转膜。脱脂牛奶(5%)封闭，于4 ℃摇床中用稀释1 000倍的一抗孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜3次，稀释5 000倍的二抗孵育1.5 h，PBS洗膜3次，ECL化学发光试剂盒显像。利用化学发光荧光成像仪的图像分析功能对条带灰度进行分析，计算目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值作为半定量结果。
2.7 统计学分析
实验所得的所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析。实验结果符合正态分布的用表示，采用单因素方差分析比较组间差异，两两比较方差齐性者采用独立样本t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 幼鼠状况观察及存活率
模型组和各给药组幼鼠在感染后6 h出现进食减少、精神萎靡、活动减少、呼吸急促。第2，3天出现呼吸频速，进食饮水进一步减少，身体蜷缩，抓取时反应迟钝，尤以模型组幼鼠明显。部分模型组幼鼠出现呼吸困难，颜面部、四肢紫绀，开始出现死亡；第4，5天开始恢复，克林霉素组、柴葛芩连汤高剂量组幼鼠上述症状恢复较快，且以柴葛芩连汤高剂量组幼鼠状态较佳，死亡减少。实验5 d后，假手术组无死亡幼鼠，存活率为100%；模型组剩余31只，存活率为62%；克林霉素组剩余38只，存活率为76%；柴葛芩连汤高剂量组，剩余41只，存活率为82%；柴葛芩连汤低剂量组剩余34只，存活率为68%。各组存活的幼鼠数量均足够用于各项实验。
3.2 对MRSA肺炎幼鼠肺内菌落计数的影响
实验5 d后，模型组肺内菌落计数为[(5.7±0.7)×106 CFU·mg-1]，与柴葛芩连汤高剂量组[(2.4±0.5)×104 CFU·mg-1]，柴葛芩连汤低剂量组[(3.9±0.8)×104 CFU·mg-1]，克林霉素组[(1.8±0.5)×104 CFU·mg-1]肺内菌落计数均比假手术组[(1.0±0.2)]×102 CFU·mg-1]高(P<0.05)；各给药组与模型组相比，肺内菌落计数显著减少(P<0.05)，其中克林霉素组、柴葛芩连汤高剂量组(P<0.01)。
3.3 对MRSA肺炎幼鼠肺病理学结构的影响
HE染色后观察到，假手术组幼鼠肺组织结构完整，肺泡边缘整齐，肺泡腔内无异常；肺炎模型组幼鼠肺内组织结构模糊，无法识别肺泡，大量细菌弥漫在整个肺内，部分炎性细胞破裂坏死，细支气管上皮细胞部分坏死，其腔内有大量的炎性细胞，同时血管周围水肿，并有纤维组织渗出；克林霉素组幼鼠肺内组织中，少部分肺泡腔融合，肺泡壁毛细血管呈现略有扩张以及少量炎性细胞浸润；柴葛芩连汤高剂量组幼鼠肺内组织中，部分肺泡腔融合，肺泡壁毛细血管呈现略有扩张以及炎性细胞的浸润；柴葛芩连汤低剂量组幼鼠肺内组织中，部分肺泡形态无法识别，仍有较多细菌散布在肺内，炎症细胞可见有破裂现象，有组织渗出。见图1。
3.4 对MRSA肺炎幼鼠肺中IL-16，TNF-α的影响
给药5 d后，与假手术组比较，模型组IL-16，TNF-α显著增加(P<0.01)；与模型组比较，各给药组IL-16，TNF-α表达水平明显下降(P<0.05，P<0.01)，柴葛芩连汤高剂量比低剂量作用更强。见表1。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | IL-16 | TNF-α |
|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 43.3±7.2 | 52.1±8.9 |
| 模型 | - | 676.2±30.21) | 983.2±26.91) |
| 克林霉素 | 120 | 214.2±39.03) | 280.8±56.63) |
| 柴葛芩连汤 | 200 | 333.8±27.23) | 402.8±21.33) |
| 100 | 435.4±41.62) | 551.2±41.42) |
3.5 对MRSA肺炎幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7 mRNA表达的影响
与假手术组比较，模型组幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7 mRNA的表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7 mRNA的表达水平明显降低(P<0.05，P<0.01)，柴葛芩连汤高剂量比低剂量作用更强。见表2。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | TNFR1 | Caspase-3 | Caspase-7 |
|---|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 0.113±0.017 | 0.387±0.019 | 0.263±0.051 |
| 模型 | - | 0.776±0.0401) | 1.011±0.0341) | 1.124±0.0441) |
| 克林霉素 | 120 | 0.293±0.0603) | 0.401±0.0793) | 0.307±0.0583) |
| 柴葛芩连汤 | 200 | 0.323±0.0373) | 0.511±0.0393) | 0.419±0.0863) |
| 100 | 0.514±0.0372) | 0.803±0.0522) | 0.721±0.0742) |
3.6 对MRSA肺炎幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7蛋白表达的影响
与假手术组比较，模型组幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，各给药组幼鼠肺中TNFR1，Caspase-3，Caspase-7的蛋白表达水平明显降低(P<0.05，P<0.01)，柴葛芩连汤高剂量比低剂量作用更佳。见图2，表3。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | TNFR1/β-actin | Caspase-3/β-actin | Caspase-7/β-actin |
|---|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 0.09±0.026 | 0.13±0.047 | 0.18±0.030 |
| 模型 | - | 0.79±0.0241) | 0.63±0.0311) | 1.22±0.0411) |
| 克林霉素 | 120 | 0.28±0.0143) | 0.18±0.0403) | 0.37±0.0503) |
| 柴葛芩连汤 | 200 | 0.34±0.0253) | 0.30±0.0623) | 0.50±0.0443) |
| 100 | 0.43±0.0292) | 0.41±0.0672) | 0.89±0.0412) |
4 讨论
金黄色葡萄球菌是常见的革兰氏阳性球菌，其致病力强，并且可产生多种毒素，是目前临床上感染和社区获得性感染常见的致病菌之一。自从在1951年发现了青霉素耐药的金黄色葡萄球菌开始，耐药菌株普遍出现，尤其是多重耐药的菌株。随着耐甲氧西林金葡菌感染(MRSA)的逐年上涨，重症监护病房中MRSA的感染率高达76%[1，16]，并且容易造成爆发成流行性感染并扩散。研究显示，金葡菌的定植与年龄相关，5岁以下的儿童、尤其是在2～6月婴儿更容易感染MRSA[3，16]。而由于婴幼儿的免疫功能尚不成熟，常见呼吸道黏液腺分泌不足、纤毛运动能力较差等，导致细菌在呼吸系统局部不能及时地被清除。幼儿肺炎的致病病原体常通过呼吸道入侵机体，少部分经血行入肺，有研究者推测，儿童金黄色葡萄球菌肺炎大部分来源于鼻前庭定植菌株。目前，临床常采用抗生素进行治疗。克林霉素能够抑制MRSA毒素蛋白的合成，对改善MRSA肺炎的预后有重要的作用[17-18]，因此设为阳性药物作为对照。然而，由于患儿肠道菌群结构不完善，其肠黏膜免疫功能较弱，抗生素治疗容易发生腹泻。中医学认为，肺炎属“肺炎喘嗽”的范畴。因此，在治疗肺炎湿热闭肺证患儿过程中，须从清热祛湿、宣肺开闭方面入手[5，14]。
柴葛芩连汤出自《症因脉治》，方中北柴胡、葛根解肌退热、升阳止利；黄芩片、黄连片清热燥湿，泻火解毒，柴胡伍黄芩和解少阳，葛根伍黄连清泻阳明，合则合解清利、升阳止利，使内陷阳明之邪透出少阳而解[19]。临床采用此法，往往能取得良好的效果。本文就柴葛芩连汤的作用机制进行探讨，以期为临床应用提供科学数据。结果发现，柴葛芩连汤对于幼鼠金黄色葡萄球菌肺炎模型具有较好的金黄色葡萄球菌清除作用，能较好的改善肺炎模型幼鼠肺的病理学改变。而其机制可能与其调控IL-16的自分泌通路有关。国外学者的研究显示金黄色葡萄球菌引起的严重肺炎与其激活的复杂的免疫系统信号通路失调有关[20-21]。人体呼吸系统受到金黄色葡萄球菌的侵袭后，金黄色葡萄球菌激活TNFR1通路，使得人气道上皮细胞、血管内皮细胞，THP-1和Jurkat T细胞会分泌大量的IL-16，TNF-α，引发肺炎，IL-16参与了自分泌信号通路，中和IL-16可以增强对金黄色葡萄球菌的清除，减轻肺的病理学改变[22-25]。另一方面，Caspase-3，Caspase-7通路的激活，也能导致THP-1细胞分泌IL-16，TNF-α，从而加剧炎症[20，26]。模型组各指标均有显著改变，可见造模成功。柴葛芩连汤的干预能降低TNFR1和Caspase-3，Caspase-7的表达，可能是其中和IL-16，增强肺炎金黄色葡萄球菌的清除作用，减轻金黄色葡萄球菌肺炎模型幼鼠肺部病理学的改变，从而对肺炎幼鼠起到治疗的作用，且有较明显的量效关系。虽然柴葛芩连汤组在炎症因子的水平及凋亡蛋白表达的控制效果未及克林霉素效果好，但是柴葛芩连汤组高剂量组幼鼠在呼吸状态及活动状态方面恢复比克林霉素中更好，且存活率也较高，可能与该复方的其他作用机制有关，有待进一步探讨。在本研究发现，柴葛芩连汤可显著改善金黄色葡萄球菌引起的幼鼠肺部炎症浸润，机制可能是通过下调IL-16，TNF-α，从而降低TNFR1和Caspase-3，Caspase-7的表达。因此本研究发现柴葛芩连汤可改善金黄色葡萄球菌引起的肺炎，为临床应用提供相应的参考。
