干燥综合征(Sjogren's syndrome,SS)是以淋巴细胞增殖以及外分泌腺进行性损伤为特征的一种自身免疫病,在我国人群中患病率约为0.33%~0.77%,以中老年女性多见[1]。SS属于中医学“燥痹”范畴,临床上可分为原发性干燥综合征(pSS)和继发性干燥综合征(sSS)两类。我们认为pSS病在“津液”,其关键病机为津液的生成及输布异常,可分为津液生成不足所致的阴虚津亏证、津液输布异常所致的津液失布证。舌诊是中医学望诊体系中的重点,通过观察舌体、舌质、舌苔、舌底络脉的变化可以大体把握疾病的内在病理变化情况。舌居口中,舌象异常也代表着口腔微环境的异常,而不同舌象所代表的不同中医证候类型其口腔局部微生态有很大可能存在差别。本研究以“舌象-证型-口腔微环境”的相关性为基础,对pSS不同证型所代表的口腔微环境特征及差异性进行分析,旨在为临床辨治pSS提供思路。本研究通过北京中医药大学东方医院伦理委员会批准(批件号:JDF-IRB-2021051402)。
1 资料
1.1 诊断标准
西医诊断标准根据美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(ACR/EULAR)pSS标准[2]制定。
中医辨证标准参考《中医常见证诊断标准(下)》[3]、《实用中医风湿病学》[4]并结合pSS的主要特征性表现制定。
1)阴虚津亏证。主症:(1)口燥咽干,渴欲饮水,或吞咽干性食物需频繁饮水帮助;(2)两眼干涩无泪,眼部磨砂感。次症:(1)多发龋齿或猖獗龋齿;(2)腮腺肿大;(3)皮肤干燥;(4)女性阴道干涩;(5)手足心热,心烦失眠;(6)形体消瘦;(7)大便干结,小便短黄。舌脉:舌干燥红绛,有裂纹,苔少或剥脱或无苔;脉细数。
2)津液失布证。主症:(1)口燥咽干,渴而不欲饮水,甚或饮则不适;(2)两眼干涩无泪,眼部磨砂感。次症:(1)疲倦乏力、易汗出、低热、纳差便溏、关节疼痛;(2)脘腹痞满、肢困身乏、大便黏腻不爽;(3)皮肤紫癜、肌肤甲错、局部刺痛;(4)猖獗龋齿、腮腺肿大、关节肿痛。舌脉:舌淡嫩胖大或有齿痕,脉迟缓无力;舌质紫暗,或有瘀点瘀斑,苔少或无苔,舌下络脉瘀曲,脉细涩;舌红苔薄黄而干,脉细数。
凡具备主症2项,或主症1项、次症2项,结合舌脉,即可诊断。
1.2 纳入标准
pSS患者纳入标准:1)符合以上西医诊断及中医辨证标准;2)女性,年龄40~70岁;3)唾液腺受损程度为中度,即唾液流率为0.1~0.7 ml/min,或腺体超声评估分级为2级或3级,或病情活动度评分为轻度或中度;4)近1周内未饮用酸奶、牛奶、乳酸菌饮品;5)近3个月内未服用抗生素;6)签署知情同意书。
健康受试者纳入标准:1)女性,年龄40~70岁;2)无口干、口腔溃疡等口腔相关疾病;3)近1周内未饮用酸奶、牛奶、乳酸菌饮品;4)近3个月内未服用抗生素;5)签署知情同意书。
1.3 排除标准
1)合并其他口腔疾病;2)合并糖尿病、病毒性肝炎等可能引起口干症状的疾病;3)合并有其他风湿性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、白塞病等;4)既往3个月内使用激素治疗。
1.4 一般资料
纳入2021年1-12月北京中医药大学东方医院风湿科门诊及住院部的pSS患者,共20例。根据既往pSS口腔菌群相关文献[5-7]中的样本量多为8例以上,同时满足生物学重复≥3的最小样本量要求,设置本研究中各组最低样本量为8例。根据中医辨证标准将20例pSS患者分为津液失布组11例、阴虚津亏组9例,同时期招募的健康受试者8例设为正常组。
1.5 主要试剂及仪器
PBS缓冲液(pH7.4,货号:10010023),美国Gibco公司;含HF缓冲液的高保真PCR混合物(货号:M0531S)、高保真DNA聚合酶(货号:M0530S),美国New England Biolabs 公司;建库试剂盒(货号:FC-121-3001),美国Illumina公司。生物分析仪(型号:Agilent 2100),美国Agilent公司;超声波破碎仪(型号:Covaris S2 System),美国Massachusetts公司;测序仪(型号:Novaseq 6000 PE250),美国Illumina公司;琼脂糖水平电泳仪(型号:DYCP-32C型),北京市六一仪器厂;离心机(型号:D3024R),美国Scilogex公司;PCR仪(型号:T100PCR),美国Bio-Rad公司。
2 方法
2.1 观察指标及方法
2.1.1 口干严重程度
采用口干视觉模拟评分(VAS)[8]及简化版口腔干燥量表(SXI)[9]评估两组患者口干严重程度。VAS可视分析标尺共10 cm,其中“0”表示口腔湿润、无口干感觉,“1~3”表示轻度口干,“4~6”表示中度口干,“7~10”表示重度口干。SXI量表包括:1)感觉口腔干燥;2)进食干燥的东西感觉困难;3)进餐时口腔感觉干燥;4)吞咽食物困难;5)嘴唇感觉干燥。使用5分Likert量表评分,根据“从不”“几乎没有”“偶尔有”“经常”“很频繁”分别计为1、2、3、4、5分。
2.1.2 口腔菌群检测
各组受试者均于8:00-10:00进行取样。受试者取样前30 min内不进食、饮水、吸烟或嚼口香糖。取样前20 min用纯净水漱口并吐尽残留液体,静坐20 min。样本采集:含漱PBS缓冲液(pH7.4)10 ml,含漱液在口中至少保持2 min;含漱液吐于15 ml无菌离心管中,立即旋紧瓶盖;4 ℃、4000 r/min离心(半径10 cm)10 min,弃上清液,取沉淀转移至2 ml EP管中;收集完毕后,贴好标签,-20 ℃保存,0.5 h内转移至-80 ℃冰箱保存备用。
1)DNA抽提和PCR扩增。采用CTAB对样本的基因组DNA进行提取,之后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,取适量的样品于离心管中,使用无菌水稀释样品至1ng/µl。使用341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(5'-GGA- CTACNNGGGTATCTAAT-3')引物对V3+V4可变区进行PCR扩增。
2)Illumina NovaSeq测序。根据PCR产物浓度进行等浓度混样,充分混匀以后使用1×TAE浓度2%的琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物,选择割胶回收目标条带。使用建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量和文库检测,合格后使用NovaSeq 6000 PE250测序仪进行上机测序。
3)生物信息学分析。对测序得到的原始序列数据进行过滤处理,得到有效数据。基于有效数据进行可操作分类单元(OTU)聚类,形成OTU物种丰度谱。分析每组特征微生物对组间差异的贡献度,特征微生物表示在对应分组中的丰度相对较高,设置线性判别分析(LDA)筛选值,LDA值代表每组物种对差异影响的大小[10],LDA>2表明差异有统计学意义。采用Shannon稀释性曲线、observed species稀释性曲线分析物种饱和度,采用Chao1指数、Shannon指数、observed OTU指数分析物种Alpha多样性,并进行组间Beta多样性分析。
2.2 统计学方法
采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料均符合正态分布,采用(
3 结果
3.1 各组受试者一般资料比较
津液失布组患者平均年龄(59.54±7.95)岁,平均病程(108.80±32.80)个月;阴虚津亏组平均年龄(60.11±10.37)岁,平均病程(73.44±51.33)个月;正常组平均年龄(52.25±5.01)岁。各组受试者年龄比较差异无统计学意义,两组患者病程比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3.2 两组患者口干VAS评分和SXI评分比较
津液失布组患者口干VAS评分为(4.00±1.73)分,阴虚津亏组为(7.00±2.06)分,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。津液失布组SXI评分为(12.45±1.81)分,阴虚津亏组为(20.33±3.54)分, 两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。
3.3 各组受试者口腔菌群分析结果
3.3.1 数据拆分结果及各组OTU差异韦恩图
测序数据拆分后获得有效序列2 366 361条,有效序列范围为54 470~102 710条,平均84 512条。各组患者口腔菌群多样性指数均>4,实际OTU数目均>200,且稀释曲线趋于平缓,表明现有测序深度已涵盖样本中能够检测到的所有物种,本次测序结果可反映当前样本中所包含的微生物多样性信息,继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU。
津液失布组、阴虚津亏组、正常组样本聚类得到的OTU差异韦恩图显示,3组共有630个相同的OTU,正常组有1288个特征OTU,阴虚津亏组有1770个特征OTU,津液失布组有1989个特征OTU。各组口腔菌群OTU韦恩图见图1。
3.3.2 各组受试者口腔菌群丰度差异分析
根据所占比例确定5个优势群落,各组口腔菌群组成在门水平方面的优势群落丰度比较见表1。与正常组相比,津液失布组和阴虚津亏组厚壁菌门丰度均升高,阴虚津亏组梭杆菌门丰度降低(P<0.05或P<0.01)。津液失布组与阴虚津亏组各菌门水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
组别 | 例数 | 厚壁菌门 | 拟杆菌门 | 变形菌门 | 梭杆菌门 | 放线菌门 |
---|---|---|---|---|---|---|
正常组 | 8 | 0.21±0.05 | 0.23±0.06 | 0.28±0.14 | 0.13±0.05 | 0.06±0.03 |
津液失布组 | 11 | 0.34±0.12a) | 0.24±0.07 | 0.20±0.11 | 0.11±0.03 | 0.06±0.05 |
阴虚津亏组 | 9 | 0.39±0.13a) | 0.25±0.06 | 0.18±0.08 | 0.07±0.05b) | 0.09±0.06 |
根据所占比例确定9个优势群落,各组口腔菌群组成在属水平方面的优势群落丰度比较见表2。与正常组相比,阴虚津亏组韦荣氏球菌属丰度升高,卟啉单胞菌属丰度降低(P<0.05)。津液失布组与阴虚津亏组各菌属丰度差异无统计学意义(P>0.05)。
组别 | 例数 | 普雷沃菌属 | 链球菌属 | 奈瑟球菌属 | 韦荣氏球菌属 | 梭杆菌属 |
---|---|---|---|---|---|---|
正常组 | 8 | 0.14±0.04 | 0.08±0.05 | 0.14±0.12 | 0.03±0.02 | 0.10±0.05 |
津液失布组 | 11 | 0.18±0.07 | 0.16±0.09 | 0.08±0.07 | 0.09±0.08 | 0.07±0.03 |
阴虚津亏组 | 9 | 0.19±0.06 | 0.16±0.08 | 0.05±0.08 | 0.13±0.08a) | 0.05±0.05 |
组别 | 例数 | 嗜血杆菌属 | 罗氏菌属 | 卟啉单胞菌属 | 纤毛菌属 | |
正常组 | 8 | 0.04±0.02 | 0.04±0.02 | 0.06±0.02 | 0.03±0.01 | |
津液失布组 | 11 | 0.05±0.04 | 0.04±0.04 | 0.03±0.03 | 0.04±0.03 | |
阴虚津亏组 | 9 | 0.08±0.04 | 0.03±0.03 | 0.02±0.03a) | 0.02±0.01 |
3.3.3 各组受试者口腔菌群组间差异筛选结果
在门水平上,阴虚津亏组、津液失布组与正常组组间比较,正常组优势菌门为梭杆菌门(LDA值为4.17,下同)、螺旋体门(3.96)、软壁菌门(3.54)、互养菌门(3.13);津液失布组优势菌门为GN02(3.37)、SR1(3.03);阴虚津亏组优势菌门为厚壁菌门(4.65)。在属水平上,LDA>2的菌种数量较多,因此选择LDA>4条件下的特征微生物。阴虚津亏组、津液失布组、正常组比较,正常组优势菌属为梭杆菌属(4.50)、密螺旋体属(4.27)、卟啉单胞菌属(4.25)、不动杆菌属(4.12);津液失布组优势菌属为链球菌属(4.67);阴虚津亏组优势菌属为韦荣球菌属(4.74)、放线菌属(4.31)。
3.3.4 各组受试者口腔菌群多样性分析
各组口腔菌群Alpha多样性指数比较:表3示,与正常组比较,阴虚津亏组Shannon指数明显下降(P<0.05),chao1、observed OTU指数差异均无统计学意义(P>0.05),津液失布组各指数差异均无统计学意义(P>0.05);阴虚津亏组与津液失布组各指数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
组别 | 例数 | chao1指数 | observed OTU指数 | Shannon指数 |
---|---|---|---|---|
正常组 | 8 | 564.29±90.75 | 562.50±91.24 | 6.87±0.39 |
津液失布组 | 11 | 550.97±90.97 | 549.64±90.68 | 6.65±0.39 |
阴虚津亏组 | 9 | 513.57±129.52 | 513.00±129.47 | 6.37±0.46a) |
各组口腔菌群Beta多样性分析比较:表4示,正常组与津液失布组、正常组与阴虚津亏组口腔菌群组成结构差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),阴虚津亏组与津液失布组组成结构差异无统计学意义(P>0.05)。
比较组别 | pseudo-F检验 | P值 | q值 |
---|---|---|---|
正常组与津液失布组 | 1.728700 | 0.010 | 0.015 |
正常组与阴虚津亏组 | 3.090798 | 0.001 | 0.003 |
津液失布组与阴虚津亏组 | 1.313328 | 0.094 | 0.094 |
4 讨论
从本研究韦恩图来看,正常组、津液失布组、阴虚津亏组均检测到大量的特征性OTU序列,可明显将3组样本区分开来,证实本研究分组方式较为合理,具有一定的研究价值。通过对各组口腔菌群的优势群落的丰度差异分析发现,与正常组比较,阴虚津亏组厚壁菌门、韦荣氏球菌属丰度升高而梭杆菌门、卟啉单胞菌属丰度降低,津液失布组厚壁菌门丰度升高;津液失布组与阴虚津亏组两组之间未见丰度有差异的菌种,提示相对津液失布组而言,阴虚津亏组与正常组相比菌群丰度有差异的菌门、菌属较多,阴虚津亏组患者口腔微生态失衡更加严重。此外,阴虚津亏组韦荣氏球菌属丰度(0.13±0.08)是正常组丰度(0.03±0.02)的4倍以上,这与其他研究[11]结果一致,提示韦荣氏球菌属可以作为pSS患者的口腔微生物标志物。结合本研究对患者口干症状的评价,阴虚津亏组口干VAS评分、SXI评分明显高于津液失布组,提示阴虚津亏组患者口腔干燥的主观症状更加突出,在一定程度上表明阴虚津亏组患者病情更严重。
本研究运用线性判别法进一步在门水平和属水平方面寻找各组口腔菌群的优势菌种,结果发现正常组、津液失布组、阴虚津亏组之间特征菌种存在一定的差异。阴虚津亏组优势菌属为韦荣氏球菌属、放线菌属,津液失布组优势菌属为链球菌属,在属水平上的菌群物种可以明确显示各组间物种的差异性[12],因此以相关菌属为代表的口腔微环境可以用于揭示pSS不同证型之间的差异。Alpha多样性指数主要用于分析单个样品中菌群的丰富度(即种类、数量)与均匀度[13],其中chao1指数和Observed OTU指数用于反映样品中菌群的丰富度[14],Observed OTU指数代表样本中实际发现的OTU数量,chao1指数是基于观测结果所预测出的理论丰富度,其值越高,表明该样本菌群丰富度越高[15];Shannon指数代表该样本菌群组成的数量及均匀度,数值越高则该样本菌群数量和均匀度越高,多样性越复杂[13]。本研究分析不同证型口腔菌群的Alpha多样性,结果显示仅阴虚津亏组与正常组之间的Shannon指数差异具有统计学意义,说明阴虚津亏组菌群数量和均匀度较正常组显著下降;而正常组与津液失布组、津液失布组与阴虚津亏组的组间差异均无统计学意义,提示以上组别之间菌群丰度及均匀度差异均不明显。
Beta多样性用于分析不同样本组间微生物群的组成结构的差异性[15]。本研究发现,正常组与津液失布组、正常组与阴虚津亏组的Beta多样性存在明显差异,说明pSS患者口腔菌群组成结构发生了显著变化;阴虚津亏组与津液失布组结构差异无统计学意义,说明从菌群组成结构方面无法明显区分阴虚津亏组与津液失布组。但韦恩图所示的阴虚津亏组与津液失布组各有大量的特征性OTU序列,提示两组菌群组成结构可能存在一定程度的差异性趋势,但是该差异没有统计学意义,这一结果也可能与研究纳入的样本数量较少有关。
综上,本研究初步明确了pSS患者口腔菌群组成结构及部分优势菌群丰度发生了变化,患者口腔菌群稳态失衡;不同证型pSS患者口腔微环境中的特征菌门、特征菌属,以及阴虚津亏组口腔菌群多样性显著改变。本研究受实际操作过程中门诊量及病例收集条件比较苛刻的限制,研究纳入的样本数量偏少,导致研究结论可能存在一定的偏倚。后续会在此基础上进一步扩大病例数量,探讨口腔微环境差异及舌诊在SS辨证中的重要性,为中医辨证治疗SS提供更多依据。
2016 American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism classification criteria for primary Sjogren's syndrome:a consensus and data-driven metho-dology involving three international patient cohorts
[J]. Ann Rheum Dis, 2017, 76(1): 9-16.Microbiological and bioinformatics analysis of primary Sjgren's syndrome patients with normal salivation
[J]. J Oral Microbiol,2016,8:31119. doi: 10.3402/jom.v8.31119.A preliminary study of the oral microbiota in Chinese patients with Sjögren's syndrome
[J].Arch Oral Biol,2016,70:143-148.doi: 10. 1016/j.archoralbio.2016.06.016.Molecular analysis of oral microflora in patients with primary Sjogren's syndrome by using high-throughput sequencing
[J]. Peer J,2018,6:柏志义,李媛,王海瑜等.20例不同证型原发性干燥综合征患者口腔菌群特征[J].中医杂志,2023,64(01):43-48.
BAI Zhiyi,LI Yuan,WANG Haiyu,et al.Characteristics of Mouth Flora in 20 Primary Sjogren's Syndrome Patients with Different Patterns[J].Journal of Traditional Chinese Medicine,2023,64(01):43-48.