复发性流产是指妊娠胎儿连续发生2次及以上自然流产，多发生在12周前，为育龄期女性常见疾病，其发病机制复杂且尚不明确，与遗传、感染、内分泌等多种因素有关，仍有大部分患者无法查到明确原因，称为不明原因复发性流产[1-2]。正常妊娠是一种特殊形式的母体免疫耐受，以Th2细胞因子所参与的免疫应答为主，T淋巴细胞所参与外周免疫耐受，Th2型细胞主要分泌白细胞介素-6(IL-6)等因子，参与体液免疫应答，T细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平过高导致胚胎排斥及着床失败[3-4]。患者怀孕后机体激素水平导致血液呈高凝状态，凝血功能可改变血液流变学水平，导致胎盘缺血、缺氧，影响妊娠安全性和妊娠结局[5-6]。肠道菌群参与人体营养物质的转化与吸收，与多个组织、器官存在密切作用，肠道菌群发生变化，不仅会产生多种胃肠道疾病，还可引发多种妇科疾病，肠道菌群的改变在女性生殖相关疾病的发生发展中发挥着重要作用[7]。因此可从血清炎症因子、凝血功能指标及肠道菌群变化情况探讨早期不明原因复发性流产治疗机制。复发性流产属于中医“滑胎”“数堕胎”“屡孕屡堕”范畴，指自然流产连续发生3次及以上，最早见于《诸病源候论》，“若血气虚损者……所以致胎数堕”，肾为天癸化生之源，子宫虚寒，气血运行迟滞，无以温养胎儿，可导致堕胎，瘀血阻滞，胎元生长受限，气机失调，血行逆乱，必然损及胎元[8]。现代中医认为肾虚为本而血瘀为标，治宜补肾、活血，补肾活血汤出自《伤科大成》，具有补肾活血止痛功效，为临床常用经验方。研究发现，补肾调冲方联合常规西药对肾虚血瘀型患者具有积极的治疗效果，可改善复发性流产微循环障碍，但其具体治疗机制有待深入研究[9]。本研究选取早期不明原因复发性流产肾虚血瘀证患者为研究对象，在常规西医治疗基础上给予补肾活血汤加减口服，旨在从血清炎症因子、凝血功能指标及肠道菌群探讨其治疗机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年3月至2018年10月本院收治的90例早期不明原因复发性流产肾虚血瘀证患者为研究对象，按照随机数字表法分为对照组和观察组，每组45例。其中对照组，年龄24～35岁，平均(29.14±5.13)岁；妊娠35～83 d，平均(59.77±11.36)d；既往流产2次28例，流产3次13例，流产4次4例。观察组，年龄25～38岁，平均(29.43±5.42)岁；妊娠34～81 d，平均(60.02±12.41)d；既往流产2次26例，流产3次14例，流产4次5例。两组年龄、妊娠天数、流产次数等一般资料差异无统计学意义，具有可比性，两组患者均无脱落患者。本研究经医院伦理委员会审批同意(批号2017ZYKY007)，患者或家属签署知情同意书，无病例脱落。
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准
复发性流产诊断标准[10]，① 2次或2次以上12孕周内的自然流产；②夫妇双方无遗传性疾病，染色体核型分析未见异常；③生殖道解剖结构正常；④生殖内分泌、甲状腺等内分泌正常；⑤抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗卵巢抗体等未见异常；⑥无支原体、衣原体及病毒等感染；⑦男方精液检查无见异常；⑧尿液妊娠试验呈阳性，子宫大小，胚胎或孕囊发育正常；⑨腹痛或停经后阴道出血。
1.2.2 中医辨证标准
复发性流产肾虚血瘀证参考《复发性流产诊治的专家共识》[11]和肾虚血瘀证标准，① 2次或2次以上自然流产，且每次多发生在相同月份；②阴道出血，或夹有血块，腰酸腰痛，四肢酸软，小腹疼痛，腹部下坠；③头晕，耳鸣，面色晦暗，口干咽燥，夜尿频多；④质暗红，苔薄白，脉象沉细或细涩。
1.3 纳入标准
①符合复发性流产和肾虚血瘀证诊断标准[10，12]；②年龄20～40岁已婚女性，确诊早孕且停经少于12周，既往有2次以上自然流产史；③愿意口服中药接受治疗；④知情同意，并签署知情同意书，同意按照本次研究要求患者。
1.4 排除标准[10-11]
①不符合复发性流产和肾虚血瘀证诊断标准患者；②染色体核型分析异常或有遗传性疾病患者；③生殖道解剖结构异常及内分泌异常患者；④男方抗精子抗体、抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗卵巢抗体等异常患者；⑤感染、胚胎染色体异常及男方精液常规异常患者；⑥合并有重要脏器和造血系统等严重疾病患者；⑦明确外伤、排卵障碍、输卵管阻塞等影响再次受孕患者；⑧合并妇科肿瘤、子宫内膜异位症等疾病患者；⑨不配合治疗、病例资料不全及失访患者。
1.5 治疗方法
两组患者确诊后给予口服阿司匹林(江苏平光制药有限责任公司，国药准字H32026317，25 mg/片)，1片/次，3次/d；口服醋酸泼尼松片(山东新华制药股份有限公司，国药准字H37020647，5 mg/片)，1片/次，睡前服用；口服地屈孕酮片(荷兰苏威制药，进口药品注册证号H20170211，10 mg/片)，1片/次，2次/d，早晚服用；对照组口服补肾活血胶囊(吉林敖东集团金海发药业股份有限公司，国药准字B20020094，0.3 g/粒)3粒/次，3次/d。妊娠3个月结束治疗，进行颈项透明层(NT)超声检查。观察组给予补肾活血汤加减口服治疗，补肾活血汤加减药物组成为桑寄生25 g，菟丝子25 g，续断15 g，当归10 g，阿胶10 g，砂仁6 g，黄芪20 g，丹参10 g，川牛膝10 g，甘草片6 g，药材均来源于本院中药房，并经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定均为正品。上述药材加水煎煮2次，合并煎液200 mL，100 mL/次，早晚分服用。5剂/周，妊娠3个月结束治疗，进行NT超声检查。
1.6 观察指标
1.6.1 临床疗效评价
参照《中医妇科学》[12]，5 d内阴道停止出血，腰膝酸软、小腹坠痛等症状消失，彩超检查胚胎发育与孕周相符，孕12周胎儿发育正常，中医证候积分减少≥90%为痊愈；7 d内阴道停止出血，腰膝酸软、小腹坠痛等症状明显减轻，彩超检查胚胎发育与孕周相符，孕12周胎儿发育正常，中医证候积分减少≥70%为显效；1 d内阴道停止出血，腰膝酸软、小腹坠痛等症状有所减轻失，彩超检查胚胎发育与孕周相符，中医证候积分减少≥30%为有效；超过10 d阴道停止出血，腰膝酸软、小腹坠痛等症状无改善甚至加重，孕周基本相符或小于孕周，胚胎发育不良或停止发育，中医证候积分减少<30%为无效。总有效率＝(痊愈＋显效＋有效)/总例数×100%。
1.6.2 中医证候积分
采用证候分级量化表进行腰膝酸软、小腹坠痛、头晕耳鸣和夜尿次数中医证候积分[13]，每项积分按无、轻、中、重分别计分，腰膝酸软、小腹坠痛计分为0，2，4，6分，头晕耳鸣和夜尿次数计分为0，1，2，3分。
1.6.3 血清炎症因子检查
分别于治疗前后，清晨(7：00～9：00)取静脉血2 mL，4 ℃，1 500 r·min-1离心10 min取血清，-80 ℃保存备用。通过ELx800型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清C反应蛋白(CRP)，TNF-α，IL-6和白细胞介素-8(IL-8)水平。CRP和TNF-α试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，批号分别为20160812，20161103]；IL-6，IL-8试剂盒(广州斯佳生物技术有限公司，批号分别为20171103A，20171106B)，严格按试剂盒说明书操作。
1.6.4 凝血功能指标检测
分别于治疗前后，清晨(7：00～9：00)取静脉血2 mL，4 ℃，1 500 r·min-1离心取血清，-80 ℃保存备用。通过C3510型全自动凝血分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子有限公司)检测凝血活酶时间(APTT)，凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)和纤维蛋白原(FIB)水平，APTT，TT，PT和FIB均为该公司配套试剂盒，批号分别为20171207A，20171207T，20171207P，20171207F，按试剂盒说明书检测。
1.6.5 肠道菌群检测
分别于治疗前后，清晨取患者新鲜粪便3 g，光冈法取标本1 g，置厌氧菌稀释液，振荡器快速匀浆，生理盐水逐次稀释至1×10-8倍，取50 μL涂抹于双歧杆菌和乳杆菌培养基上，37 ℃温箱培养48 h后进行定性，定量检测；取标本1 g，置需氧菌稀释液，铜钱操作，取50 μL涂抹于肠球菌、酵母菌和肠杆菌培养基上，37 ℃温箱培养48 h后进行定性、定量检测，菌落数以对数值表示。
1.7 统计学处理
采用SPSS 19.0软件统计分析数据，计量资料采用
2 结果
2.1 两组患者临床疗效比较
治疗后，观察组的总有效率高于对照组(χ2＝6.048，P<0.05)，见表1。
| 组别 | 治愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效 |
|---|---|---|---|---|---|
| 观察 | 22(48.89) | 10(22.22) | 9(20.00) | 4(8.89) | 41(91.11) |
| 对照 | 14(31.11) | 11(24.44) | 10(22.22) | 10(22.22) | 35(77.78) |
2.2 两组患者中医证候积分比较
与本组治疗前比较，治疗后两组患者的腰膝酸软、小腹坠痛、头晕耳鸣和夜尿次数等中医证候积分均降低(P<0.05)；治疗后观察组各项中医证候积分均低于对照组(P<0.05)，见表2。
| 组别 | 时间 | 腰膝酸软 | 小腹坠痛 | 头晕耳鸣 | 夜尿次数 |
|---|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 4.51±0.55 | 4.39±0.42 | 2.34±0.35 | 2.13±0.27 |
| 治疗后 | 0.72±0.231，2) | 0.69±0.261，2) | 0.62±0.231，2) | 0.35±0.171，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 4.49±0.58 | 4.44±0.45 | 2.41±0.39 | 2.50±0.34 |
| 治疗后 | 1.71±0.291) | 1.43±0.311) | 1.04±0.291) | 0.87±0.221) |
2.3 两组患者炎症因子水平比较
与本组治疗前比较，治疗后两组CRP，TNF-α，IL-6和IL-8水平均明显降低(P<0.05)；治疗后观察组CRP，TNF-α，IL-6和IL-8水平低于对照组(P<0.05)，见表3。
| 组别 | 时间 | CRP | TNF-α | IL-6 | IL-8 |
|---|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 36.12±5.03 | 70.03±7.02 | 83.55±6.72 | 42.16±3.97 |
| 治疗后 | 13.14±3.521，2) | 40.27±4.391，2) | 49.13±4.671，2) | 16.43±2.891，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 35.67±4.95 | 70.44±7.23 | 84.02±7.23 | 41.68±4.12 |
| 治疗后 | 20.62±4.111) | 53.14±4.961) | 64.08±5.721) | 24.06±4.111) |
2.4 两组患者凝血功能指标比较
与本组治疗前比较，治疗后两组患者的APTT，TT和PT水平明显升高，FIB水平明显降低(P<0.05)；治疗后观察组APTT，TT和PT水平显著高于对照组，FIB水平明显高于对照组(P<0.05)，见表4。
| 组别 | 时间 | APTT/s | TT/s | PT/s | FIB/g·L-1 |
|---|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 24.11±2.96 | 12.67±1.03 | 11.04±1.13 | 4.67±0.62 |
| 治疗后 | 32.03±2.371，2) | 15.32±0.891，2) | 14.59±0.971，2) | 2.89±0.471，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 23.89±3.12 | 12.58±0.97 | 10.86±1.21 | 4.71±0.59 |
| 治疗后 | 28.21±2.76 1) | 13.89±0.921) | 12.31±0.991) | 3.69±0.531) |
2.5 两组患者肠道菌群比较
与本组治疗前比较，治疗后两组患者的肠球菌、酵母菌和肠杆菌数量明显降低，双歧杆菌、乳杆菌数量明显升高(P<0.05)，治疗后观察组肠球菌、酵母菌和肠杆菌数量明显低于对照组，双歧杆菌、乳杆菌明显高于对照组(P<0.05)，见表5。
| 组别 | 时间 | 肠球菌 | 酵母菌 | 肠杆菌 | 双歧杆菌 | 乳杆菌 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 9.71±1.34 | 6.12±0.75 | 8.91±1.02 | 7.32±0.91 | 5.31±0.86 |
| 治疗后 | 7.86±0.911，2) | 4.58±0.561，2) | 7.41±0.641，2) | 9.11±1.031，2) | 7.11±1.051，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 9.58±1.17 | 6.17±0.81 | 9.01±0.95 | 7.29±0.97 | 5.29±0.92 |
| 治疗后 | 8.71±0.881) | 5.42±0.671) | 8.19±0.691) | 8.46±0.121) | 6.22±1.071) |
2.6 两组患者安全性评价
对照组发生寒战3例，荨麻疹2例，低烧5例，红细胞减少2例，血小板减少1例；观察组发生寒战2例，荨麻疹1例，低烧1例，红细胞减少1例。观察组不良反应发生率11.11%，低于对照组的28.89%(χ2＝4.444，P<0.05)。
3 讨论
复发性流产是育龄期妇女的常见疾病，随着社会发展和女性压力增大，复发性流产发病率逐年增加，严重影响妇女身心健康。复发性流产病因、病机错综复杂，胚胎、母体、父方及环境是引起流产的四大因素，与感染、染色体异常、内分泌因素、环境因素、凝血功能异常等多种因素有关[14]。T淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，Th1/Th2失调是不明原因复发性流产的重要原因。复发性流产多数患者阴道流血，并伴有小腹疼痛等症状，西医以激素支持治疗或免疫疗法为主[15]。研究发现，复发性流产组织中NLRP3和IL-1β基因及蛋白表达量显著升高，绒毛组织中NLRP3炎症小体表达明显增加，绒毛滋养细胞可能通过NLRP3炎症小体参与RSA的发生与发展[16]。研究发现，复发性流产患者IL-2，TNF-α，IL-10水平显著升高，寿胎丸联合地屈孕酮治疗复发性流产的疗效确切，能有效改善患者炎症因子水平，且安全可靠[17]。不明原因复发性流产凝血因子Ⅻ基因C46T多态性为T等位基因时其凝血因子Ⅻ活性更低，凝血因子Ⅻ基因C46T的基因型为CT型时可能与不明原因复发性流产的发生有关[18]。反复流产患者蜕膜组织局部免疫功能表达异常，血液处于一定程度的高凝状态，纤溶系统受损，修复上述状态可对治疗不明原因反复流产患者[19]。妊娠期糖脂代谢异常不仅可引起孕产妇孕期及产后肠道菌群结构和功能的变化，还可导致婴儿早期肠道菌群的定植异常，影响子代远期的生长发育，增加其成年后慢性代谢性疾病的发生风险[20]。妊娠糖尿病患者双歧杆菌和乳酸杆菌总菌数量减少，推测双歧杆菌和乳酸杆菌总菌在GDM的发生发展中存在一定作用，该作用可能和降低炎症因子TNF-α以及IL-6的表达有关[21]。因此，本研究从血清炎症因子、凝血功能指标及肠道菌群变化探讨补肾活血汤加减治疗早期不明原因复发性流产肾虚血瘀证的治疗机制。
复发性流产属中医“胎漏”或“胎动不安”范畴，母体肾中精气不足，脏腑功能失调，气血亏虚或孕后跌扑闪损均致气血不畅，造成冲任、胞宫的损伤，直接或间接的影响胎元的生长发育，出现胎漏、胎动不安。肾虚，胎失维系；气血虚弱，胎失所养；胞宫虚寒，胎儿失于温煦濡养；阳盛血热，血不循常道，则见胎动不安；瘀血阻滞，胞宫为离经之血所占据，则胎元生长受限。复发性流产病机在于肾虚为本而血瘀为标，治宜补肾、活血。与达芙通相比，基于补肾活血法的补肾活血汤加减治疗复发性流产的12周妊娠通过率及妊娠结局均更优[21]。补肾活血中药联合低分子肝素能有效促进妊娠早期β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌，降低D-二聚体，增加子宫供血，使ACA抗体转阴，改善妊娠结局[22]。复发性流产模型小鼠存在母胎界面血管生成的障碍，补肾安胎冲剂可以修复小鼠蜕膜组织中破坏的细胞结构，改善血管生成和细胞器完整度，发挥安胎作用[23]。本研究旨在探讨补肾活血汤加减治疗早期不明原因复发性流产肾虚血瘀证的疗效及对肠道菌群的影响。
本研究发现，治疗后，观察组的总有效率显著高于对照组，观察组的腰膝酸软、小腹坠痛、头晕耳鸣和夜尿次数等中医证候积分显著低于对照组。补肾活血汤加减方中菟丝子滋阴补肾，益精填髓，温煦肾气，促进肾精生长发育；桑寄生、续断补肾助阳，阴阳互生，气化失司充盈胞宫、冲任；山药平补脾肺肾，气阴双补；丹参、牛膝、当归补血活血，调经止痛；黄芪补气健脾，加强活血化瘀，阿胶补血滋阴，润燥；砂仁化湿和胃、安胎；炙甘草调和诸药，共奏补肾活血功效，本方滋阴补肾，补气行气，活血化瘀，补血养血，补中有泄，静中有动，补肾不滋腻，祛瘀不伤正，降低中医证候积分，发挥治疗作用。观察组的CRP，TNF-α，IL-6和IL-8水平低于对照组；观察组的APTT，TT和PT水平高于对照组，而FIB低于对照组；观察组的肠球菌，酵母菌和肠杆菌数量低于对照组，而双歧杆菌和乳杆菌高于对照组。菟丝子黄酮类物质与天然孕酮的分子结构相似，发挥作用，增加胎盘血流灌注，促进合体滋养细胞孕激素的分泌；丹参具有抗凝、抗炎等多重作用，可有效对抗血小板的聚集、降低血液黏稠度；可改善红细胞表面脂质代谢，降低血液黏稠度。与相关研究补肾活血方联合地屈孕酮治疗肾虚血瘀型复发性流产临床疗效确切，从整体上调节机体免疫平衡使妊娠得以维持，补肾固冲方通过上调RORγt转录水平，下调FoxP3转录水平，优势诱导Treg亚群分化，逆转Th17/Treg失衡结果一致[24-27]。
综上所述，补肾活血汤加减治疗早期不明原因复发性流产肾虚血瘀证具有较好的临床疗效，可降低中医证候积分，其机制可能与降低炎症反应，改善凝血功能及肠道菌群有关，且具有良好的安全性，值得临床推广应用。
