俄罗斯地处“一带一路”沿线国家，国土广袤，土壤气候条件多样，赋予了俄罗斯丰富的草药资源，但其尚存草药资源开发和应用程度远远不够深入的局面，因此需要充分利用俄罗斯丰富的药用植物资源，开展俄罗斯草药资源调查工作，对于发掘中药新药源，丰富中医临床用药等具有重要意义。本研究利用DNA条形码技术，对俄罗斯阿尔泰及高加索地区野外药用植物进行基原鉴定工作，调查其分布状况，对于“一带一路”沿线国家药用植物资源开发具有重要借鉴意义。
真核生物的核糖体DNA存在串联结构与多拷贝数的基因家族，其结构可划分为编码18S rDNA，5.8S rDNA，26S rDNA及分别位于三者中间的内转录间隔区(ITS1，ITS2)，ITS序列由于在进化过程中承受的选择压力小，因此发生突变的概率大大增加，其片段的插入、缺失和替换是较为常见的，能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状，因此可作为代表该物种的DNA条形码[1-3]。利用DNA条形码在药用动植物种质资源研究中取得的成果已得到国内外学者的肯定[4-5]。张蓉等[6]通过遗传距离和分子系统进化树分析显示DNA条形码鉴别方法能够在种属水平上将鹿科3属9种鹿成功的鉴别，对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定。张改霞等[7]基于ITS2条形码对药用植物羌活种子进行分子鉴定，研究证实DNA条形码技术可用于羌活种子基原鉴别，为中药材种质资源鉴定提供了新方法、新依据。马晓冲等[8]对土木香基于DNA条形码鉴定做了大量工作，对易混淆的木香、川木香、土木香、青木香、红木香等品种进行鉴别，结果表明利用ITS2序列能准确鉴定到物种，使木香类药材鉴别方法简便易行，为临床安全用药提供可靠依据。
1 俄罗斯地理概况
俄罗斯联邦是由22个自治共和国，46个州，9个边疆区，4个自治区，1个自治州，3个联邦直辖市组成的联邦共和立宪制国家。俄罗斯位于欧亚大陆北部，地跨欧亚两大洲，地跨欧亚两洲，面积1 709.82万平方公里。俄罗斯大部分地区处于北温带，气候多样，以温带大陆性气候为主，1月平均温度为-18～-10 ℃，7月平均温度为11～27 ℃，年降水量平均为150～1 000 mm。俄罗斯森林覆盖面积为了7.06亿公顷，占领土总面积的40%。远东阿尔泰地区植物资源丰富，生长着2 000余种植物，其中100余种药用植物已开发生产诸多俄罗斯草药产品。该地区许多植物种群、植物多样性与中国东北及新疆地区药用植物类群类似，物种重叠明显。高加索地区气候处于温带和亚热带之间，高加索山脉生物群落的垂直变化十分明显，海拔2 000 m为农作物耕区系，2 000～2 800 m为针叶林和高山草甸区系，2 800～3 500 m为冰雪覆盖寒冷区系，不同海拔植物多样性变化也非常显著。高加索独特的气候变化带，在较小范围类孕育了丰富的植物物种。针对俄罗斯生物多样性明显的这2个区域的药用植物资源进行调查，具有很强的代表性。
2 材料
2.1 样品
2017年8月采摘于俄罗斯阿尔泰及高加索地区，样品凭证标本保存于北京中医药大学中药学院C309实验室。
2.2 试剂
植物基因组DNA提取试剂盒(Biomiga，批号2611021802220001)，Mix酶等聚合酶链式反应(PCR)试剂(北京博迈德生物有限公司，批号726381AC)，琼脂糖，乙醇，ddH2O等。
2.3 仪器
1-14型离心机(Sigma)，TC-5000型PCR扩增仪(Techne)，DYY-6C型电泳仪，水平电泳槽，WD-9413B型凝胶成像分析仪(北京六一仪器厂)，820HTD型超声波清洗机(深圳市观益佳科技有限公司，40 kHz，480 W)，-20 ℃超低温冰箱(Haier)；XMA-600型电热恒温鼓风干燥箱，XMTD-600型恒温水浴锅(余姚市益成智控技术有限公司)。
3 调研方法
3.1 野外标本采集
本课题组与2017年8月在俄罗斯地区进行野外药用植物样本采集工作，首先抵达俄罗斯阿尔泰共和国地区，该区域位于俄罗斯、中国、蒙古、哈萨克斯坦交界处，北纬52°20′18.83″，东经87°6′12.08″，海拔415 m。随后前往俄罗斯西部黑海之边克拉斯诺达尔市周边山区，调研俄罗斯西部高加索地区植被及草药生长分布情况，北纬44°31′23.08″，东经38°38′29.57″，海拔412～789 m。
3.2 DNA提取及PCR扩增
取样品，观察形态，形态结果一致。取标本叶片进行DNA提取。样本用液氮冷冻后研磨成细粉，采用植物DNA提取试剂盒提取总DNA。
3.3 ITS序列PCR扩增
采用ITS序列通用引物在热循环扩增仪上进行扩增。ITS上游引物P1：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物P4：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTC-3′。PCR扩增条件：20 μL体系含2×Taq PCR MasterMix 10 μL，引物P1和P4各加1 μL(μmol·L-1)，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检视，后送PCR原液至北京中林希科公司测序部测序。各样品均采用正向、反向测序，以保证测序的准确性。用ContigExpress软件对测序所获得的正向、反向序列进行拼接，根据NCBI数据库BLAST(相似性搜索法)所获相似度最高物种的同属ITS序列边界，截取待鉴定物种的ITS序列，用DNAman对待鉴定物种的ITS序列和参比ITS序列进行相似度分析，利用MEGA 7软件作进化树分析。
3.4 美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库分析
3.4.1 相似度对比
通过NCBI核酸数据库的BLAST对比功能，检索经截取后的待鉴定样品ITS序列，综合考虑各项指标后，下载Ident值在99%以上的物种ITS序列，其作为参比序列，然后用DNAman软件进行相似度分析，将结果中相似度最高的物种初步作为待鉴定样品的基源。见图1。
3.4.2 参比ITS序列筛选
由于NCBI的核酸数据库中所注册序列的物种可能会出现错误鉴定，因此需要对相似度最高的参比序列进行筛选。既从NCBI网站上下载与待鉴定药材相似度最高物种的ITS序列，利用Mega 7软件构建这些序列和参比序列的系统发育树。
3.4.3 系统发育分析
选择一种近缘属植物为外类群，利用Mega 7软件构建待鉴定样品和参比ITS序列的系统发育树，Kimura-2参数遗传距离，采用邻接法构建邻接法(NJ)系统树，发育树各分支的置信度用自举检验法检验，共进行2 000次循环，根据聚类结果进行鉴定。
4 结果
4.1 药用植物种类特点
此次所采集的样品标本，通过形态学观察结合DNA条形码技术，共鉴定出的药用植物覆盖17科44属51种。含1种药用植物的单种科为10科10种，占本区药用植物总科数58.82%的和总种数的19.6%；含2～4种的药用植物5科15种，占本区药用植物总科数和总种数的29.41%；含6～7种的药用植物为2科13种，占本区药用植物总科数11.76%的和总种数的25.49%；本区药用植物种类最多的是菊科，共12种，占总种数的23.52%。查阅《俄罗斯药典》及《中国药典》，发现鉴定的药材中有29种具有明确的药用价值，其余22种的药用价值待挖掘。见表1。
| No. | 中文名 | 拉丁名 | NCBI登录号 | 药用价值 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 高山蓍 | Achillea alpina | KX670802.1 | 全草入药，能清热解毒、袪风止痛。茎叶含芳香油，可作调香原料 |
| 2 | 两色乌头 | Aconitum alboviolaceum | KF022316.1 | 根用于高血压，关节疼痛 |
| 3 | 北乌头 | Aconitum kusnezoffii | KR082763.1 | 炮制品治风湿性关节炎、神经痛、牙痛、中风等症。块根可作农药，防治稻螟虫、棉蚜等虫害，以及棉花立枯病、小麦杆锈病等病害，也可消灭蝇蛆、孑孓等。叶用于热病发热，泄泻腹痛，头痛，牙痛 |
| 4 | 龙蒿 | Artemisia dracunculus | KX581805.1 | 用于治胸腹胀满、消化不良 |
| 5 | 大狼杷草 | Bidens frondosa | KY968965.1 | 全草用于呼吸道感染，咽喉肿痛，感冒，急性阑尾炎，黄疸性肝炎，胃肠炎，痢疾，风湿关节炎，疟疾；外用于疔疮，蛇伤，跌打肿痛 |
| 6 | 狭叶柴胡 | Bupleurum scorzonerifolium | KR902821.1 | 感冒发热，寒热往来，疟疾，胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛 |
| 7 | 黑柴胡 | Bupleurum smithii | KR902826.1 | 外感发热；寒热往来；疟疾；肝郁胁痛乳胀；头痛头眩；月经不调；气虚下陷之脱肛；子宫脱垂；胃下垂 |
| 8 | 匍匐风铃草 | Campanula rapunculoides | HQ823434.1 | 治疗狂犬病 |
| 9 | 蔓蝉 | Cicerbita racemosa | AJ633326.1 | 治疗癫痫，闭经和便秘 |
| 10 | 野胡萝卜 | Daucus carota | AY552527.1 | 防止血管硬化，降低血压及减少心脏病，增强免疫功能，益肝明目，通便，抗过敏 |
| 11 | 东方山羊豆 | Galega orientalis | DQ311966.1 | 发汗、利尿和驱虫药 |
| 12 | 黄海棠 | Hypericum ascyron | JN984874.1 | 平肝，止血，败毒，消肿。治头痛，吐血，跌打损伤，疮疖 |
| 13 | 牛膝草 | Hyssopus officinalis | JQ669106.1 | 化痰、止咳、祛风寒、杀菌，用于咳嗽、头痛，哮喘及寒性引起的感冒发烧，气管炎引起的咳嗽气喘等 |
| 14 | 土木香 | Inula helenium | FN870378.1 | 健脾和胃，调气解郁，止痛安胎之功效。用于胸胁、脘腹胀痛，呕吐泻痢，胸胁挫伤，岔气作痛，胎动不安 |
| 15 | 野芝麻 | Lamium barbatum | KC350619.1 | 治肺热咳血，血淋，白带，月经不调，小儿虚热，跌打损伤，肿毒 |
| 16 | 牧地山黧豆 | Lathyrus pratensis | AY839384.1 | 肺气壅实、咳嗽痰多、胸满喘急之证 |
| 17 | 无 | Lavatera thuringiaca | EF419451.1 | 传染性疾病、癌症 |
| 18 | 突厥益母草 | Leonurus turkestanicus | EF395809.1 | 月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒 |
| 19 | 柳穿鱼 | Linaria vulgaris | KJ747021.1 | 清热解毒、散瘀消肿，利尿。黄疸，头痛，头晕，痔疮便秘，皮肤病，烫伤 |
| 20 | 阔荚苜蓿 | Medicago platycarpos | KX788055.1 | 清胃热，利尿除湿 |
| 21 | 草木犀 | Melilotus officinalis | DQ311985.1 | 治疗结喉，狂犬病，久热，毒热 |
| 22 | 野薄荷 | Mentha arvensis | DQ667325.1 | 传统上用叶子制成的茶叶用于治疗发烧，头痛，消化系统疾病和各种轻微疾病。叶子是治疗胃癌的经典药物。全草用于麻醉、消炎、解痉、防腐、芳香、驱风、发汗 |
| 23 | 宽叶石防风 | Peucedanum terebinthaceum | AY548216.1 | 用于感冒、风湿痹痛 |
| 24 | 细距舌唇兰 | Platanthera bifolia | MF944372.1 | 用于儿童和疗养者的功能食品，治疗胃肠道刺激 |
| 25 | 金露梅 | Potentilla fruticosa | AF163478.1 | 根的汁液用于治疗消化不良 |
| 26 | 狗筋麦瓶草 | Silene vulgaris | KJ918500.1 | 润肤作用，植物汁液用于治疗眼炎 |
| 27 | 乌苏里藜芦 | Veratrum nigrum var. ussuriense | JF807683.1 | 动脉闭塞 |
| 28 | 马鞭草 | Verbena officinalis | JN575351.1 | 外用治疗轻伤，湿疹，疮，神经痛和牙龈疾病。叶和开花茎具有止痛，抗菌，抗凝血，解痉，收敛，清理，发汗，温和利尿 |
| 29 | 欧洲荚蒾 | Viburnum opulus | KY860934.1 | 强效抗痉挛药，主要用于治疗哮喘，痉挛和其他症状，如绞痛或月经痛 |
4.2 中俄部分草药习用功效差异分析
俄罗斯传统医药源于希腊，随后又整合了鞑靼人和蒙古族传统药物以及阿拉伯传统医药体系特点，形成了独特的俄罗斯医药体系。因此，俄罗斯药典记载的习用传统草药有许多品种与我国中草药品种虽然相同，但在习用功效方面与我国中医药既有联系，又有区别。下表列举了20种部分《俄罗斯药典》记载品种中俄[9]间功效及临床应用差异的比较。见表2。
| No. | 拉丁名 | 中文名 | 俄罗斯传统功效[9] | 功效[10] |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Ledum palustre | 杜香 | 祛痰 | 化痰、止咳、平喘 |
| 2 | Calendula officinalis | 金盏花 | 抗感染性和抗炎 | 清热平喘、凉血止血 |
| 3 | Centaurea cyanus | 矢车菊 | 利尿 | 补心壮阳、燥湿固精 |
| 4 | Crataegus sanguinea | 辽宁山楂 | 心血管病 | 消食积、化滞瘀 |
| 5 | Leonurus cardiaca | 益母草 | 镇静 | 活血调经、利尿消肿 |
| 6 | Origanum vulgare | 牛至 | 祛痰 | 清暑解表、利水消肿 |
| 7 | Polygonum aviculare | 扁蓄 | 利尿 | 功专利水清热、除湿杀虫 |
| 8 | Polygonum hydropiper | 水蓼 | 止血 | 清火解毒、消肿止痛 |
| 9 | Thymus serpyllum | 铺地百里香 | 祛痰 | 治白带、久不胎孕 |
| 10 | Taraxacum officinale | 蒲公英 | 刺激食欲和利胆 | 清热解毒、消肿散结、利尿通淋 |
| 11 | Bergenia crassifolia | 厚叶岩白菜 | 外用止血 | 滋补强壮、止咳止血 |
| 12 | Polygonum bistorta | 拳参 | 止血 | 清热利湿、凉血止血 |
| 13 | Acorus calamus | 水菖蒲 | 食欲兴奋剂，利胆 | 化痰开窍、除湿健胃、杀虫止痒 |
| 14 | Inula helenium | 土木香 | 祛痰 | 健脾和胃、行气止痛 |
| 15 | Valeriana officinalis | 缬草 | 镇静 | 清热、解毒、镇静 |
| 16 | Cucurbita moschata | 南瓜 | 驱虫 | 解毒消肿 |
| 17 | Schisandra chinensis | 五味子 | 滋补 | 收敛固涩、益气生津 |
| 18 | Laminaria saccharina | 海带 | 润肠通便 | 清热止痛、软坚散结、清胆止泻 |
| 19 | Tussilago farfara | 款冬花 | 化痰 | 润肺下气、化痰止咳 |
| 20 | Hyoscyamus niger | 天仙子 | 抗胆碱作用 | 解泾昌涌、安心定痫 |
5 讨论
俄罗斯作为世界上领土面积最为广阔的国家，拥有极为丰富的中草药资源，民族复杂多样，孕育了独特的传统医药体系和用药特色。我国中草药市场需求巨大，再加上老龄化社会的来临，中药草药市场需求将进一步扩大。为此，俄罗斯草药资源开发前景十分广阔。俄罗斯草药资源与我国巨大的市场需求存在显著的优势互补性，为“一带一路”沿线国家野外新药资源开发工作奠定重要基础。本研究开展了俄罗斯境内野外药材资源普查工作，通过DNA条形码技术结合性状鉴定结果，进一步确定了俄罗斯野外药用植物的分布现状，为俄罗斯药用植物资源普查提供重要的借鉴意义，为新药的开发提供了新的优质原料、扩大了中医临床用药的资源。
俄罗斯独特用药习惯和临床经验具有重要的借鉴意义。在俄罗斯传统用药习惯的影响下，许多俄罗斯习用药与我国中药在功效和临床应用方面存在较大差异。如表2所示，土木香俄罗斯民间用作祛痰药，而在我国土木香具有健脾和胃、行气止痛之功效，常用于脾胃运化失调等疾病的治疗。又比如益母草，在俄罗斯常用作镇静药使用；而中药益母草，具有活血调经、利尿消肿之功，是妇科之要药。可见，俄罗斯传统草药用药特点与我国中医药用药存在较大差异，这种“差异”可为我国中药功效“再评价”或进行新药开发提供重要的借鉴意义。本研究是在“一带一路”项目支持下，进行俄罗斯野外特色药用植物资源调查，为加强一带一路建设奠定了重要基础。