心血管疾病是目前危害人类健康的首要疾病，据WHO统计，女性心血管疾病的病死率高于男性[1]。动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病形成的主要病理基础之一，有效防治AS对于预防心脑血管疾病发生发展至关重要。女性AS的发病与年龄密切相关，女性更年期前AS发病率低于男性，更年期后发病率要高于同年龄的男性[2]。据统计，我国6.5亿女性将有1/3的时间在绝经后渡过。因此，对绝经后女性AS的防治意义重大。现代研究已证实，雌激素对心血管系统具有直接保护作用[3]。绝经后女性AS的发病与雌激素水平下降密切相关。更年期女性雌激素水平下降，雌激素对心血管系统的保护作用减弱，故AS发病率升高[4]。虽然雌激素替代疗法可降低AS发病风险，但存在致癌风险，因此，对绝经期女性AS防治需探寻更安全的方法。
中医认为AS病机变化以血瘀、痰壅、寒凝为标，气虚、阳虚或阴虚为本，肾为人体阴阳之根本，故与肾有直接关系[5]。女子七七肾气衰，肾气虚则肾阳不足，心阳根于肾阳，肾阳虚可致心气心阳不足，无力行血，而致气虚血瘀；阳虚亦不能温养血脉，致血寒而凝；肾阴不足，无以生血，脉道空虚，血行失畅，血液瘀滞；阴虚火旺，虚火炼液成痰，煎熬心血可致瘀。因此，肾虚是绝经后AS发生发展的病理基础，补肾之阴阳是防治更年期动脉粥样硬化有效手段。加味二至丸是在二至丸基础上加上淫羊藿组方而成。方中女贞子滋补肝肾，墨旱莲补肾滋阴，兼能凉血止血。两味药合用，其性平和、偏寒，补肾养阴血而不滋腻，为平补肝肾之良方。淫羊藿补肾阳，强筋骨，祛风湿，三药合用，补肾阴的同时，兼顾补阳，调节人体阴阳平衡。加味二至丸在临床应用多年，通过前期临床研究发现，该方能够改善绝经后女性雌激素缺乏症状，调节血脂代谢，促进一氧化氮(NO)的释放，改善绝经后女性的胰岛素抵抗，而不增加血中雌激素水平[6-7]。动物实验也证实加味二至丸可降低卵巢切除小鼠血清甘油三酯水平并改善小鼠的糖耐量[8]。更年期女性AS的发病机制较为复杂，雌激素水平下降、脂质代谢，炎症反应，胰岛素抵抗等与更年期女性AS均密切相关。加味二至丸成分复杂，靶点众多，其作用机制尚不明确。因此，本研究通过利用网络药理学方法，建立加味二至丸-AS-靶点互作网络，诠释加味二至丸治疗AS的可能作用机制，以期为更年期女性AS的防治提供新的治疗方法。
1 方法
1.1 加味二至丸活性成分与潜在靶点筛选
本研究采用中药系统药理学分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索女贞子、墨旱莲、淫羊藿3味中药的全部化学成分，TCMSP数据库以化合物口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为活性化合物的筛选条件[9]。同时在中医分子机理生物学信息分析工具(BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)对该3味药进行检索，检索条件为score cutoff≥20，P-value cutoff<0.05[10]；检索的化合物成分须符合OB≥30%和类DL≥0.18，得到对应的化合物靶点。将两个数据库的成分预测靶点合并，建立加味二至丸化学成分-靶点数据库。
1.2 AS疾病靶点的确定
通过药物靶标数据库(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，比较毒理基因组学数据库(CTD，http：//ctdbase.org/)，在线《人类孟德尔遗传》数据库(OMIM，https：//www.omim.org/)以及DisGenet，http：//disgenet.org/检索与AS相关靶点。
1.3 成分-靶点网络构建
利用用韦恩图取交集，获得加味二至丸-AS的共同靶点，并进行药物成分靶点-AS疾病靶点映射，利用Cytoscape 3.6.1软件构建“活性成分-作用靶点”网络，药物活性成分和作用靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。
1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建
将加味二至丸-AS共同作用靶点导入STRING(https：//string-db.org/)数据库中，以置信度分数score>0.9为条件进行筛选，并隐藏网络中无联系的节点，余参数不变，将得到的结果以文本形成导入Cytoscape3.6.1软件中进行可视化，并使用Cytoscape3.6.1的插件(MCODE)筛选重要的蛋白互作(PPI)网络的模块，筛选标准为degree cutoff＝2，node score cutoff＝0.2，K-score＝2，max deapth＝100，P<0.05表示差异具有统计学意义[11]。
1.5 基因本体(GO)功能与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析
利用David 6.8数据库( https：//david.ncifcrf.gov/)对加味二至丸和AS共同作用靶点蛋白进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能。KEGG富集分析可以得到加味二至丸和AS共同靶点所富集的信号通路。GO和KEGG分析均以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 加味二至丸化合物的筛选
通过在TCMSP及BATMAN-TCM平台检索，并将2个数据库筛选结果合并，共获得加味二至丸化学成分38个(见表1，根据OB值例举前10个)，其中墨旱莲10个，麦冬10个，五味子23个，共有成分5个，预测靶点共266个。
| Molecule ID | 化合物 | OB | DL | 药物 |
|---|---|---|---|---|
| MOL005212 | olitoriside_qt | 103.23 | 0.78 | 女贞子 |
| MOL003402 | demethylwedelolactone | 72.13 | 0.43 | 墨旱莲 |
| MOL005190 | eriodictyol | 71.79 | 0.24 | 女贞子 |
| MOL002975 | butin | 69.94 | 0.21 | 墨旱莲 |
| MOL005211 | olitoriside | 65.45 | 0.23 | 女贞子 |
| MOL000622 | magnograndiolide | 63.71 | 0.19 | 淫羊藿 |
| MOL004367 | olivil | 62.23 | 0.41 | 淫羊藿 |
| MOL004388 | 6-hydroxy-11，12-dimethoxy-2，2-dimethyl-1，8-dioxo-2，3，4，8-tetrahydro-1H-isochromeno[3，4-h]isoquinolin-2-ium | 60.64 | 0.66 | 淫羊藿 |
| MOL004576 | taxifolin | 57.84 | 0.27 | 女贞子 |
| MOL003389 | 3′-O-methylorobol | 57.41 | 0.27 | 墨旱莲 |
2.2 AS疾病靶点筛选
通过在TTD，CTD，OMIM和DisGenet数据库检索，并结合相关文献共得到与AS疾病相关人类靶点254个。
2.3 治疗AS化合物及潜在靶点筛选
通过韦恩图找出加味二至丸和AS共同靶基因，得到52个，见图1。52个基因对应化合物有29个(女贞子8个，墨旱莲8个，淫羊藿18个)，见图2。图2中黄色节点代表3个中药，红色菱形节点代表化合物，绿色圆形节点代表基因靶点，一个节点的自由度表示网络中和节点相连接的边的数目。对图2进行拓扑分析可以看出，有4个化合物的作用靶点数量>10，分别为MOL000098槲皮素(40个)，MOL000422山柰酚(16个)，MOL000006木犀草素(11个)，MOL003402去甲基蟛蜞菊内酯(11个)，这些化合物有可能在治疗AS过程中起着重要的作用。此外，靶点基因前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)与26个化合物相联系，其次是雄激素受体(AR)19个，雌激素受体(ESR1)12个，共有28个基因至少与2个化合物相互作用，这说明PTGS2，AR，ESR1可能在加味二至丸作用于AS的重要靶点，同时也说明加味二至丸治疗AS的机制十分复杂。
2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的构建
将52个共同靶点导入STRING中，结果见图3(图中线条粗细代表作用力强弱)，将结果以文本形式导出，然后导入Cytoscape 3.6.1软件中，利用Cytoscape软件中的MCODE插件将加味二至丸靶点PPI网络进行聚类分析，见图4，其聚类详细信息见表2。
| 类簇(cluster) | 类簇中包含的靶点 | MCODE聚类评分 | 类簇中包含节点数 | 类簇中包含边数 |
|---|---|---|---|---|
| a | 白细胞介素(IL)-10，肿瘤坏死因子(TNF)，IL-6，IL-1β，IL-1α，趋化因子2(CCL2)，细胞间黏附因子-1(ICAM1)，干扰素基因(IFNG) | 6.571 | 8 | 23 |
| b | 视黄酸受体(RXRA)，一氧化氮合酶(NOS2)，过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA) | 3 | 3 | 3 |
| c | 转化生长因子-β1(TGF-β1)，促生长因子2(IGF2)，人纤溶酶原激活物抑制剂1(SERPINE1) | 3 | 3 | 3 |
2.5 加味二至丸-AS-基因的生物学过程
根据显著性程度P<0.05(P值由小到大)进行部分展示，GO分析结果提示加味二至丸-AS-基因的生物过程(BP)显著富集在类固醇激素介导的信号通路、炎症反应、氧化应激、细胞因子的分泌调节、一氧化氮的合成调节、胰岛素分泌等；分子功能(MF)主要富集在类固醇激素受体活性、细胞因子活性，胆固醇O-酰基转移酶活性、血红素结合、一氧化氮合酶活性等。细胞组分(CC)主要富集在细胞外空间、细胞外基质、核、核染色质、质膜外侧、细胞外区域等。见表3。
| 类别 | 基因功能 | 数目/个 | P |
|---|---|---|---|
| BP | 类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediated signaling pathway) | 4 | 3.10×10-5 |
| BP | 脂多糖介导的信号通路(lipopolysaccharide-mediated signaling pathway) | 4 | 4.50×10-5 |
| BP | 去除超氧自由基(removal of superoxide radicals) | 3 | 6.80×10-4 |
| BP | 细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide) | 4 | 8.30×10-4 |
| BP | 细胞因子分泌的积极调节(positive regulation of cytokine secretion) | 3 | 9.90×10-4 |
| BP | 一氧化氮生物合成过程的积极调节(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process) | 3 | 1.40×10-3 |
| BP | 调节胰岛素分泌(regulation of insulin secretion) | 3 | 1.80×10-3 |
| BP | 蛋白激酶B信号传导(protein kinase B signaling) | 3 | 4.00×10-3 |
| BP | 葡萄糖代谢过程(glucose metabolic process) | 3 | 4.70×10-3 |
| BP | 炎症反应(inflammatory response) | 5 | 6.20×10-3 |
| CC | 细胞外空间(extracellular space) | 20 | 3.60×10-12 |
| CC | 细胞外基质(extracellular matrix) | 5 | 2.90×10-4 |
| CC | 核(extracellular matrix) | 17 | 1.80×10-3 |
| CC | 核染色质(nucleus) | 4 | 6.60×10-3 |
| CC | 质膜外侧(nuclear chromatin) | 4 | 9.00×10-3 |
| CC | 细胞外区域(extracellular region) | 6 | 1.50×10-2 |
| MF | 类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity) | 6 | 2.00×10-6 |
| MF | 细胞因子活性(cytokine activity) | 7 | 8.60×10-6 |
| MF | 类固醇结合(steroid binding) | 3 | 2.80×10-3 |
| MF | 胆固醇O-酰基转移酶活性(cholesterol O-acyltransferase activity) | 2 | 8.30×10-3 |
| MF | 血红素结合(heme binding) | 4 | 9.70×10-3 |
| MF | 一氧化氮合酶活性(nitric-oxide synthase activity) | 2 | 1.20×10-2 |
2.6 加味二至丸-AS-基因的生物学通路
KEGG富集分析得到通路42条，根据P<0.05并结合相关文献进行筛选，得到与AS相关通路22条，见图5。其中与疾病相关通路有9条，类风湿关节炎、炎症性肠病、癌症中的转录失调、癌症的途径、癌症中的蛋白多糖，结核，Ⅰ型糖尿病，非酒精性脂肪性肝病，乙型肝炎；炎症相关通路4条，TNF信号通路、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)信号通路、用于IgA生成的肠道免疫网络)；此外还有低氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、胰岛素抵抗、氧化物酶增殖物激活受体(PPARs)信号通路等。分析结果表明，加味二至丸可能通过作用于这些通路起到防治AS的作用。
3 讨论
3.1 加味二至丸组方分析
二至丸药药少而精，配伍精妙，具有滋补肝肾之功效，常用于治疗更年期女性相关疾病，如更年期综合症，骨质疏松等。现代药理研究表明，二至丸具有调节免疫机能、缩短血液凝血时间、改善血液流变性、抗炎、抗氧化等作用[12]。广州中医药大学洪创雄教授在二至丸的基础上加入补阳药淫羊藿，独创加味二至丸，其意有二，一是阴阳双补，协调平衡，即补阴不忘阳，补阳不忘阴，正所谓“无阳则阴无以生，无阴则阳无以化”；二是现代药理研究表明淫羊藿有植物雌激素效应[13]，其主要成分淫羊藿总黄酮具有抗动脉粥样硬化、改善血流动力学等心血管保护作用[14]。因此，该方既能对更年期女性AS的防治起到一定作用，又能避免雌激素替代疗法带来的副作用。三药合用，全方共奏滋补肝肾，调和阴阳之功。
3.2 加味二至丸成分分析
通过分析得出加味二至丸治疗AS的有效成分有29个，包括槲皮素、山柰酚、木犀草素、去甲基蟛蜞菊内酯等，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素均为黄酮类化合物，具有很好抗炎，抗氧化应激、抗血小板聚集等心血管保护作用[15]。此外，斛皮素能够抑制低密度脂蛋白氧化，具有内皮依赖性血管舒张作用[16]。木犀草素能够有效抑制肿瘤坏死因子诱导的血管炎症反应[17]；并能够抑制TGF-β1型受体信号传导抑制血管平滑肌细胞增殖[18-19]；调节尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX4)/活性氧(ROS)/NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路，抑制NOX4和ROS的表达，从而缓解氧化应激[20]。去甲基蟛蜞菊内酯能显著提高香烟烟雾提取物干预的肺支气管上皮细胞超氧化物歧化酶的活力，下调丙二醛的含量，显著降低环氧化酶-2和ICAM1的表达[21]。
3.3 关键靶点分析
通过对加味二至丸-AS-基因网络分析可以发现，有12个化合物通过ESR1起作用。ESR1是雌激素的作用靶点，调控着雌激素水平。雌激素对血管具有直接保护作用，雌激素可直接作用于内皮细胞、平滑肌细胞、血管外膜的成纤维细胞，并能够调节血脂，增强抗氧化性能等[22]；此外，还能促进NO的释放，减轻血管损伤反应[23]。动物实验研究证实，二至丸能够提高血中雌二醇水平，并上调雌激素受体表达，发挥雌激素样作用[24]。另有研究表明，女贞子配伍淫羊藿能够发挥雌激素作用，改善绝经后骨质疏松[25]。本课题组前期研究也表明，加味二至丸能够改善更年期患者雌激素缺乏导致的临床症状，但并不增加血清雌二醇水平[7]。这说明加味二至丸可能通过作用于雌激素受体，调节雌性激素水平发挥抗AS的作用。
此外，本研究通过对加味二至丸PPI网络进行聚类分析得出了其中显著性较强的3个模块，其中显著性最强的模块a中包含IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α，CCL2等炎症相关因子，这表明加味二至丸可能通过抑制炎症反应发挥抗AS作用[26]。ICAM1为免疫球蛋白超家族成员，主要表达于内皮细胞、血管平滑肌细胞表面，AS发展和进展的重要因素，研究表明AS患者的ICAM1明显增加[27]。γ干扰素(IFN-γ)在AS病变中以高水平表达，并参与了AS的各个阶段[28]。有研究发现，二至丸能够降低酒精性肝损伤大鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平，说明二至丸具有一定的抗炎作用[29]。综上所述，加味二至丸可能通过调节上述基因靶点的表达，减轻由其引发的免疫反应、炎症反应，从而延缓AS的发生和发展。
3.4 通路结果分析
目前研究认为，炎症在AS病理过程中起着基础性作用。KEGG富集分析结果显示，加味二至丸有较多基因靶点有富集在与炎症相关的疾病通路和信号通路，这提示，加味二至丸可能通过作用于这些炎症因子靶点，调节炎症信号通路，抑制炎症反应，从而发挥抗AS的作用。TNF信号通路，NF-κB信号通路，NOD样受体信号通路与炎症密切相关。TNF参与细胞生长和增殖、炎性和免疫反应等过程，TNF信号通路的激活，能够激活诱导NF-κB入核，激活NF-κB信号通路，促进TNF-α，IL-6，IL-8等炎症因子的释放，从而引起和加重机体炎症反应[30]。NOD样受体信号途径的激活促进AS的发展，NOD蛋白质是重要模式识别受体，NOD样受体主要包括NOD1和NOD2，能够活化NF-κB和MAPK信号通路，促进细胞释放IL-6，IL-8，CCL2，TNF-α等促炎因子，促进机体炎症反应。此外，NOD1，NOD2能够与Toll样受体协同增强机体的免疫反应，当机体炎症和免疫反应太过，则会对血管造成损伤，促进AS的形成[31]。研究表明，载脂蛋白E(ApoE)和Nod1双敲除小鼠证实可以减少AS早前病变，延缓AS进展[32]。综上所诉，加味二至丸有可能通过调节TNF信号通路，NF-κB信号通路及NOD样受体信号通路，来抑制IL-6，IL-8，TNF-α等炎性因子的产生。
加味二至丸具有调节过PPAR信号通路的潜在作用。PPAR信号通路对AS的发展和糖代谢起着重要的调节作用。PPAR主要有PPARα，PPARβ和PPARγ 3种表型。研究表明，PPARα和PPARγ的激活能通过抑制血管内皮炎症反应，抑制细胞增殖和迁移，抑制单核细胞转化成泡沫细胞，减少血管细胞黏附分子-1，ICAM1表达等多个方面，发挥抗AS的作用[33]。PPARγ对糖代谢的调节主要是增加外周组织对胰岛素的敏感性，从而改善胰岛素抵抗[34]。本研究发现PPAR信号通路上有加味二至丸与AS的共同靶点PPARα，PPARβ，PPARγ，课题组前期研究也发现，加味二至丸能改善更年期患者的胰岛素抵抗，因此，推测加味二至丸可能通过调节PPAR信号通路，改善胰岛素抵抗来防治AS。
综上所述，加味二至丸可能通过作用于雌激素受体发挥植物性雌激素作用来治疗AS，同时研究发现加味二至丸可能通过作用于IL-10，IL-6，TNF等多个靶点，调节TNF信号通路，NF-κB信号通路，NOD样受体信号通路，PPAR信号通路等，通过抑制炎症反应，改善胰岛素抵抗等机制治疗AS，该研究为深入探讨加味二至丸治疗更年期女性AS的作用机制提供了指导。
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[J]．中国实验方剂学杂志，2019，doi：10.13422/j.cnki.syfjx.20191461.