糖尿病是一种复杂的代谢疾病，其特征是血糖水平升高，胰岛素分泌和胰岛素作用缺陷。2015年全球糖尿病发病率超过4.15亿，预计到2040年将达到6.42亿[1]。随着我国经济发展，糖尿病患病率迅速上升，糖尿病与心血管病和肿瘤已成为威胁人民健康的三大慢性病。在过去的30年里，经过7次全国性调查发现，中国大陆的糖尿病发患者群增长了17倍，并且糖尿病和糖调节异常在中国已经逐渐成为了流行病[2]。由于发病机制不同，糖尿病有1型和2型两种主要形式[3-4]。2型糖尿病(T2DM)影响了90%～95%的糖尿病患者，是全球超过3.8亿人的一个重要健康问题。传统疗法如胰岛素和其他口服药物有导致低血糖症的危险，从而进一步加重患者的经济负担。因此，迫切需要开发出最佳有效的治疗方法。最近，基于其安全性、成本和有效性，中药被认为是一种潜在的糖尿病治疗方法[5]。
小陷胸汤出自《伤寒论》，是治疗痰热互结的代表方剂，小陷胸汤治疗糖尿病及其并发症的临床研究有诸多报道，如用小陷胸汤干预糖尿病前期痰湿蕴热质患者，结果发现小陷胸汤能明显改善患者胰岛素抵抗，保护胰岛β细胞功能，阻止和逆转糖尿病的发展[6]，张增建[7]报道，加味小陷胸汤治疗73例糖尿病皮肤瘙痒症患者，能够有效消除患者皮肤瘙痒症状，复发率低，效果满意，但是由于小陷胸汤成分复杂多样，其所发挥治疗T2DM的作用机制目前尚未有明确研究报道。
由于中药成分的多样性，与人体相互作用的复杂性，中药复方的研究存在着成分过于复杂，作用机制不清的难题[8]，目前发掘复方的潜在分子机制仍然相当困难。现有研究多局限于针对某一靶点或某一基因阐释中药及中药复方的作用机制及通路，对中药多成分、多靶点、多途径的特点缺乏宏观的认识与分析[9]。随着网络药理学的提出，单一靶标的研究逐步向整体、系统的调节研究转变[10]，通过生物学网络节点的连接和关系分析“分子-靶点-通路-疾病”的多层次网络，进而阐明中药复方的作用机制，实现分子作用的综合网络分析，最终从整体角度更加透彻地了解中药与机体的相互作用。本研究运用网络药理学的技术与方法，对小陷胸汤治疗T2DM的作用机制进行从单一到整体、从部分到系统的研究，研究结果将对以后的实验研究指明方向。
1 方法
1.1 小陷胸汤的活性成分及靶点挖掘
中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)是一种独特的中草药系统药理学平台，他能捕捉药物、靶标和疾病之间的关系，能够从整体水平研究药物靶标网络和疾病网络，揭示中药性质与作用机制[11-13]。借助TCMSP在线平台(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)获取小陷胸汤(黄连片、法半夏、瓜蒌)中各个中药的化学成分，根据口服生物利用度(OB)和类药性(DL)筛选出符合条件的候选化合物其对应靶点，然后借助Uniprot数据库和美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)，将物种限定为“人”，将靶点转换成对应的基因。
1.2 T2DM相关靶点获取
以“type 2 diabetes mellitus”为检索词，在Gene Cards数据库(https：//www.genecards.org/)中搜索T2DM的相关靶点。
1.3 “中药化学成分-作用靶点”网络的构建和分析
将中药的预测靶点与T2DM相关靶点取交集，所得交集靶点即为小陷胸汤作用于T2DM的预测靶点。构建中药化学成分-作用靶点网络，利用Cytoscape3.7.1软件中的“Network Analyzer”功能对中药化学成分-作用靶点网络进行分析，节点(node)代表小陷胸汤中所含药物化学成分与潜在作用靶点；边(edge)展现了中药成分和其作用靶点之间的联系，根据化合物与靶点连接情况筛选出小陷胸汤作用于T2DM的关键化合物。
1.4 PPI网络的构建及关键靶点筛选
将药物-疾病交集靶点导入STRING(https：//string-db.org/)数据库进行蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)分析，限定研究物种为“人”(“Homo sapiens”)，最低相互作用评分设置为最高置信度[“highest confidence(0.900)”]，其余参数保持默认设置，得到小陷胸汤作用于T2DM的PPI网络。借助Cytoscape3.7.1软件中的“Network Analyzer”对PPI网络进行拓扑分析，选取自由度(Degree)，介数(Betweenness)和中心性(Closeness)都大于平均值的靶点为关键靶点。
1.5 基因本体(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析
将药物-疾病交集基因导入DAVID6.8数据库，输入靶基因名称列表，限定物种为“Homo Sapiens”，将靶基因名修正为官方名称(“official gene symbol”)，设定阈值P<0.05，进行GO分析和基于KEGG通路富集分析。
2 结果
2.1 候选化合物及靶点的筛选结果
小陷胸汤中有黄连、半夏和瓜蒌共3味中药，在TCMSP中获得此3味药化合物共244个，设定OB≥30%，DL≥0.18，得到筛选出有效化合物共38个，逐一对应靶点发现8个化合物无对应靶点，即小陷胸汤有效化合物30个，对应168个靶点。
2.2 T2DM靶点基因获取结果
从Gene Cards数据库中检索到T2DM相关靶点基因1 542个。
2.3 网络构建及分析结果
将168个化合物靶点与1 542个T2DM靶点基因取交集，得到156个交集基因，对应小陷胸汤中30个候选化合物，其中对应黄连化合物11个，半夏化合物10个，瓜蒌化合物9个，具体信息见表1。借助软件Cytocsape3.7.1构建中药化合物-靶点基因相互作用网络，网络中有186个节点(小陷胸汤化合物节点30个，靶基因节点156个)和311条边，见图1。图中度值最高的化合物为槲皮素(quercetin)，其次为R-氢化小檗碱(R-canadine)，黄芩素(baicalein)，小檗浸碱(berlambine)和β-谷甾醇(beta-sitosterol)等，见表2。这些度值较高的化合物可能是小陷胸汤发挥治疗T2DM的关键化合物。
| 药物 | 化合物名称 | CAS编号 | OB/% | DL |
|---|---|---|---|---|
| 黄连 | berberine | 2086-83-1 | 36.86 | 0.78 |
| berberrubine | 15401-69-1 | 35.74 | 0.73 | |
| epiberberine | 6873-09-2 | 43.09 | 0.78 | |
| R-canadine | 5096-57-1 | 55.37 | 0.77 | |
| berlambine | 549-21-3 | 36.68 | 0.82 | |
| corchoroside A_qt | 508-76-9 | 104.95 | 0.78 | |
| magnograndiolide | 92618-98-9 | 63.71 | 0.19 | |
| palmatine | 3486-67-7 | 64.6 | 0.65 | |
| quercetin | 117-39-5 | 46.43 | 0.28 | |
| coptisine | 3486-66-6 | 30.67 | 0.86 | |
| worenine | 38763-29-0 | 45.83 | 0.87 | |
| 半夏 | 24-ethylcholest-4-en-3-one | 84924-96-9 | 36.08 | 0.76 |
| cavidine | 32728-75-9 | 35.64 | 0.81 | |
| baicalein | 491-67-8 | 33.52 | 0.21 | |
| beta-sitosterol | 83-46-5 | 40.12 | 0.75 | |
| stigmasterol | 83-48-7 | 36.91 | 0.75 | |
| gondoic acid | 5561-99-9 | 43.83 | 0.76 | |
| coniferin | 124151-33-3 | 30.70 | 0.20 | |
| 10，13-eicosadienoic | 30223-50-8 | 31.11 | 0.32 | |
| (3S，6S)-3-(benzyl)-6-(4-hydroxybenzyl)piperazine-2，5-quinone | N/A | 39.99 | 0.20 | |
| cycloartenol | 469-38-5 | 42.15 | 0.24 | |
| 瓜蒌 | mandenol | 544-35-4 | 42.00 | 0.19 |
| diosmetin | 520-34-3 | 31.14 | 0.27 | |
| spinasterol | 481-18-5 | 42.98 | 0.76 | |
| hydroxygenkwanin | 2586-96-1 | 36.47 | 0.27 | |
| schottenol | 521-03-9 | 37.42 | 0.75 | |
| 10α-cucurbita-5，24-diene-3β-ol | 35012-08-9 | 44.02 | 0.74 | |
| 5-dehydrokarounidiol | 148016-79-9 | 30.23 | 0.77 | |
| 7-oxo-dihydrokaro-unidiol | N/A | 36.85 | 0.75 | |
| linolenic acid ethyl ester | 1191-41-9 | 43.99 | 0.50 |
| 中药 | 化合物 | CSA编号 | 边数/个 |
|---|---|---|---|
| 黄连 | 槲皮素(quercetin) | 117-39-5 | 127 |
| 黄连 | R-氢化小檗碱(R-canadine) | 5096-57-1 | 20 |
| 半夏 | 黄芩素(baicalein) | 491-67-8 | 18 |
| 黄连 | 小檗浸碱(berlambine) | 549-21-3 | 14 |
| 半夏 | β-谷甾醇(beta-sitosterol) | 83-46-5 | 14 |
| 黄连 | 巴马汀(palmatine) | 3486-67-7 | 13 |
| 半夏 | 豆甾醇(stigmasterol) | 83-48-7 | 13 |
| 黄连 | 黄连素(berberine) | 2086-83-1 | 12 |
| 黄连 | 小檗红碱(berberrubine) | 15401-69-1 | 10 |
| 黄连 | 表小檗碱(epiberberine) | 6873-09-2 | 9 |
| 半夏 | 卡文定碱(cavidine) | 32728-75-9 | 9 |
| 黄连 | 黄连碱(coptisine) | 3486-66-6 | 8 |
| 半夏 | 松柏苷(coniferin) | 124151-33-3 | 7 |
| 黄连 | 甲基黄连碱(worenine) | 38763-29-0 | 6 |
2.4 靶蛋白相互作用网络的构建及关键靶点筛选结果
为了进一步研究小陷胸汤治疗T2DM的作用机制，将156个映射得到的交集靶点通过STRING数据库进行PPI网络分析，见图2。网络中有135个靶点可以发生蛋白相互作用(有21个靶点未发生蛋白相互作用)，489条边代表了蛋白之间相互作用。网络中各节点的平均自由度为7.244，平均介数为1.14×10-3，平均中心度数为0.468，自由度、介数、中心度数均超过平均值的靶点有18个，见表3。推测这些靶点可能是小陷胸汤治疗T2DM的关键靶点。
| 基因 | 全称 | 自由度 | 介数 | 中心度数 |
|---|---|---|---|---|
| JUN | 原癌基因jun(jun proto-oncogene) | 32 | 0.014 58 | 0.576 |
| AKT1 | 丝氨酸/苏氨酸激酶1(serine/threonine kinase 1) | 30 | 0.003 45 | 0.484 |
| RELA | 原癌基因RELA(RELA proto-oncogene) | 25 | 0.008 04 | 0.558 |
| IL-6 | 白细胞介素-6(interleukin 6) | 22 | 0.004 93 | 0.508 |
| EGFR | 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor) | 19 | 0.012 88 | 0.692 |
| FOS | 原癌基因fos(Fos proto-oncogene) | 19 | 0.005 05 | 0.514 |
| CXCL8 | c-x-c基序趋化因子配体8(C-X-C motif chemokine ligand 8) | 18 | 0.005 63 | 0.579 |
| PRKCA | 蛋白激酶Cα(protein kinase C alpha) | 17 | 0.004 46 | 0.472 |
| PRKCB | 蛋白激酶Cβ(protein kinase C beta) | 15 | 0.005 41 | 0.700 |
| RB1 | Rb转录共压子1(RB transcriptional corepressor 1) | 14 | 0.005 33 | 0.833 |
| IL-1β | 白细胞介素-1β(interleukin-1 beta) | 14 | 0.002 62 | 0.833 |
| EGF | 表皮生长因子(epidermal growth factor) | 14 | 0.005 96 | 0.667 |
| CASP8 | 凋亡蛋白酶-8(Caspase-8) | 12 | 0.007 18 | 0.600 |
| CYP1A1 | 细胞色素P450家族1亚家族成员1(cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1) | 10 | 0.003 34 | 0.750 |
| CASP3 | 凋亡蛋白酶-3(Caspase-3) | 9 | 0.002 20 | 0.556 |
| PPARG | 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma) | 9 | 0.001 64 | 0.500 |
| ICAM1 | 胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1) | 8 | 0.001 78 | 0.571 |
| ERBB2 | erb-b2受体酪氨酸激酶2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2) | 8 | 0.001 29 | 0.571 |
2.5 GO功能分析结果
156个小陷胸汤-T2DM交集基因影响了75个生物学过程(P<0.01，FDR<0.01)，选取P值排名前20的功能信息，见表4，图3。图表显示小陷胸汤活性成分主要富集在应对药物，RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控、应对脂多糖、DNA模板转录正调节、应对雌二醇、老化、应对缺氧、血管收缩正调节、应对有毒物质、血管生成正调节、一氧化氮生物合成过程的正调控、应对乙醇、炎症反应等生物过程中；在分子功能方面，主要在涉及了固醇激素受体，RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、蛋白结合、血管收缩的正调节、转录因子结合、应对有毒物质、相同的蛋白质结合等；在细胞组成方面主要和细胞外间隙有关。
| ID | Term | 总数 | P |
|---|---|---|---|
| GO∶0042493 | response to drug | 29 | 2.94×10-20 |
| GO∶0019899 | enzyme binding | 28 | 2.91×10-18 |
| GO∶0005615 | extracellular space | 48 | 1.44×10-17 |
| GO∶0045944 | positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter | 42 | 9.19×10-17 |
| GO∶0003707 | steroid hormone receptor activity | 13 | 8.51×10-14 |
| GO∶0032496 | response to lipopolysaccharide | 18 | 1.76×10-13 |
| GO∶0045893 | positive regulation of transcription, DNA-templated | 28 | 2.10×10-13 |
| GO∶0004879 | RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding | 11 | 6.17×10-13 |
| GO∶0032355 | response to estradiol | 14 | 2.19×10-12 |
| GO∶0007568 | aging | 17 | 2.65×10-12 |
| GO∶0001666 | response to hypoxia | 17 | 5.04×10-12 |
| GO∶0005515 | protein binding | 122 | 7.10×10-12 |
| GO∶0045907 | positive regulation of vasoconstriction | 10 | 9.01×10-12 |
| GO∶0008134 | transcription factor binding | 20 | 1.32×10-11 |
| GO∶0009636 | response to toxic substance | 13 | 1.83×10-11 |
| GO∶0042802 | identical protein binding | 30 | 3.28×10-11 |
| GO∶0045766 | positive regulation of angiogenesis | 14 | 4.62×10-11 |
| GO∶0045429 | positive regulation of nitric oxide biosynthetic process | 10 | 1.66×10-10 |
| GO∶0045471 | response to ethanol | 13 | 2.32×10-10 |
| GO∶0006954 | inflammatory response | 21 | 3.24×10-10 |
2.6 KEGG富集通路分析结果
KEGG通路富集分析发现，156个交集靶点基因显著富集在44条通路上(P<0.05，FDR<0.01)其中17条通路与T2DM密切相关，见图4，其中最有意义的10条通路包括缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路，肿瘤坏死因子(TNF)信号通路，Toll样受体信号通路，甲状腺激素信号通路，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，乙型肝炎，丙型肝炎，酷氨酸激酶受体2(ErbB)信号通路，钙离子信号通路和核转录因子-κB(NF-кB)信号通路，提示小陷胸汤通过作用以上多条通路来发挥治疗T2DM的作用。
3 讨论
本研究基于网络药理学的技术，借助相应的数据库和软件，构建了网络并对靶点进行了通路富集分析，科学系统地探讨了小陷胸汤治疗T2DM的作用机制。
研究显示，小陷胸汤发挥治疗T2DM的关键化合物有槲皮素、黄芩素、黄连素、小檗红碱、表小檗碱等。已有研究报道，槲皮素可能通过抗氧化应激和抗炎来减轻胰岛素抵抗，还能通过腺苷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)途径改善胰岛素抵抗状态，发挥治疗T2DM的作用[14-15]；黄芩素能够通过清除自由基和抗氧化[16]、降低血脂、抑制α-葡萄糖苷酶活性[17]、调节炎症细胞因子[18]、保护β细胞功能[19]等途径来降低血糖；小檗碱能够通过抑制Toll样受体与脂多糖结合而减轻炎症反应，改善胰岛素抵抗[20]，还能抑制氧化应激和炎症反应抑制T2DM发生和发展[21]。本研究结果与以上报道相符，说明小陷胸汤治疗T2DM具有多成分共同作用的特点
GO功能富集分析提示小陷胸汤治疗T2DM可以通过作用多个靶点来发挥作用。
KEGG富集通路分析发现17条通路与T2DM发病密切相关，其中多条通路与T2DM及其并发症的关系已被实验或临床研究验证，例如，患有乙肝或丙肝的患者更容易发生糖尿病，可能机制在于肝炎病毒感染会导致肝脏代谢异常，进而产生胰岛素抵抗[22]，乙肝病毒可以通过损伤肝功能而导致肝脏糖代谢异常[23]，丙肝病毒可以影响胰岛素信号传导、影响脂代谢和损伤胰岛细胞等，从而促使糖尿病的发生发展[24]；HIF-α和糖尿病及其并发症的发生发展关系密切[25]，高糖缺氧状态下，细胞中会聚集大量HIF-α，加重糖尿病患者缺血缺氧状态而促进糖尿病并发症发生[26]；TNF能够通过促进炎症因子的释放来诱导细胞凋亡[27]，TNF-α与胰岛素抵抗有密切关系[28]，机制可能与TNF-α通过激活NF-κB信号通路，抑制胰岛素信号传导有关[29]，此外，血清TNF-α水平与糖尿病肾病病程呈正相关，可能机制在于TNF-α通过产生炎性反应细胞因子，增加微血管通透性，从而损伤糖尿病肾小球组织[30]；Toll样受体信号通路的激活与胰岛素抵抗有关，糖尿病患者体内Toll样受体TLR2和TLR4的表达增多，会促进β细胞凋亡，抑制胰岛素分泌，且导致胰岛素敏感性下降，进而促进糖尿病的发展[31-33]，高糖或高脂可以激活Toll样受体4，促使靶细胞脱敏而加重胰岛素抵抗[34-35]；糖尿病患者甲状腺水平下降会降低胰岛素敏感性、提高心血管疾病发生的风险[36]，游离三碘甲状腺原氨酸FT3会随着肾功能的减弱而下降[37]，FT3水平的下降与糖尿病肾病的不良预后有密切关系，可能与肾灌注减少、血脂紊乱和动脉硬化等有关[38]；PI3K/Akt信号通路与葡萄糖代谢有着密切关系，该通路被抑制可引起胰岛素抵抗进而发生T2DM[39]；ErbB2受体信号转导缺陷容易导致心脏受损[40-41]，链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠实验证明ErbB2受体活化抑制会减弱其对心脏的保护，诱导细胞凋亡[42]；细胞内钙离子浓度与胰岛β细胞的分泌功能呈正相关[43]，研究表明骨钙素能够促进胰岛β细胞增殖、增加胰岛素分泌，提高机体对胰岛素的敏感性，还可以直接作用于胰岛细胞或通过脂联素途径来参与调节血糖代谢[44-46]；高糖刺激可以激活NF-κB，促进内皮细胞的凋亡，进而导致糖尿病心血管并发症[47-48]。
小陷胸汤可以通过干预以上通路发挥治疗T2DM作用，例如，黄连素可以降低慢性肝炎患者和IL-1和TNF-α表达，显示出明显的抗炎作用[49]，还可以很好地保护T2DM大鼠的大血管，减轻糖尿病大鼠的糖尿病并发症状，机制可能是其能够改善糖脂代谢并能够激活PI3K/Akt/eNOS通路[50]；槲皮素可以通过降低机体氧化应激水平而降低T2DM大鼠的血糖[51]，还可以有效抑制血管平滑肌细胞的TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等炎症因子分泌[52]；小檗碱可以阻止脂多糖和Toll样受体结合来降低炎症反应、改善胰岛素抵抗从而发挥治疗T2DM作用[20]，可以很好地保护T2DM心肌病大鼠的心肌结构和心脏功能损伤[53]，还能够通过抑制肝脏组织中的NF-κB p65蛋白活性来阻断胰高血糖素信号通路，从而降低空腹血糖水平[54]；黄连可以抑制热证模型大鼠血清中FT3含量的降低，使甲状腺功能恢复正常[55]；黄芩素能够升高细胞内钙离子浓度来促进胰岛素分泌，发挥治疗T2DM的作用[56]，还可以通过调节细胞内钙离子浓度、参与抗氧化来抑制缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡[57]。
本研究结果结合已有报道发现，小陷胸汤可以通过干预以上多条通路来发挥治疗作用。
综上所述，本研究基于网络药理学的方法和技术，阐述了小陷胸汤治疗T2DM的活性成分、作用靶点和作用通路之间的关系，发现小陷胸汤多成分、多靶点、多通路的特点，通路富集结果提示小陷胸汤治疗T2DM的机制可能是通过抑制炎症因子分泌，参与抗炎反应，降低氧化应激，升高细胞内钙离子浓度阻断胰高血糖素信号通路，激活PI3K/Akt通路等来改善胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，降低血糖。
本研究为进一步的实验研究和临床应用提供思路和参考依据，也为中药复方作用机制提供了新方向。但是，本研究依旧存在一些不足需要解决，如网络药理学是基于数据进行研究，数据搜集的全面与否及活性成分筛选标准的制定尚不能做到完全准确。此外，本研究尚未考虑药物剂量及煎服方法对治疗结果的影响，因此本研究组将在今后进一步通过实验去验证本研究结果。
Treatment of diabetes mellitus using iPS cells and spice polyphenols
[J]．J Diabetes Res，2017, doi：10.1155/2017/5837804.Baicalein protects against type 2 diabetes via promoting islet β-cell function in obese diabetic mice
[J]. Int J Endocrinol, 2014，doi：10.1155/2014/846742.The rhizome mixture of anemarrhena asphodeloides and coptidis chinensis ameliorates acute and chronic colitis mice by inhibiting the binding of lipopolysaccharide to TLR4 and IRAK1 phosphorylation
[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014，10：1-11.