作为青春期和育龄期妇女常见的一种内分泌紊乱综合征，多囊卵巢综合征(PCOS)临床表现主要有月经失调、不孕、肥胖等，严重影响育龄期女性的生育问题[1]，肥胖、糖耐量减低和血脂代谢异常是PCOS所致代谢异常的三大主要表现[2-3]。既往研究显示胰岛素抵抗(IR)是其关键发病机制，PCOS患者多存在IR，主要通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通道途径实现对靶点器官、组织，实现IR，该通道过度激活或弱化，可使PCOS者糖代谢异常，使子宫内环境异常[4]。如何有效调控PI3K/Akt信号通道的正常有序表达，是改善PCOS患者IR，糖代谢异常的关键。据有关统计PCOS者合并IR的发生率高达50%～70%[5]，目前单纯应用西药治疗以改善症状和提高妊娠率为主，单纯应用西药虽能有效提高成熟卵泡数量，但其质量差，不能有效改善子宫内环境，致排卵率高，妊娠率低，流产率高。中医药多靶点、多途径的作用特点，相对于西药来说，更有利于改善PCOS患者子宫、卵巢内环境，提高临床疗效，其治疗效果得到临床认可，较具有优势，但其作用机制不是很明确[6]。温肾助阳调周法出自《金匮要略》，古人提出“益火之源，以消阴翳”，也是温肾助阳的方法[7]。贵州省名中医/妇科专家王琪教授基于上述中医理论，总结出温肾助阳调周法治疗PCOS不孕症的经验方法[8]，以自拟方暖宫助孕汤为主[9-10]，从肾阳虚为PCOS发病根本出发，结合月经周期阴阳变化规律，立温肾助阳调周法治疗PCOS及其所致不孕，该法可改善患者中医证候，提高妊娠率，降低流产率，但其具体的作用途径及机制尚不明确。故本研究旨在探讨肾阳虚证PCOS患者子宫内膜组织中胰岛素的PI3K/Akt信号通路中Akt的表达及其活化程度，并分析温肾助阳调周法对PCOS患者性激素、胰岛素及排卵的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
将贵州中医药大学第一附属医院2017年2月至2018年7月接治的60例肾阳虚证PCOS患者按随机数字表法分为两组，各30例。两组在年龄及睾酮、催乳素和体质量指数等资料比较无差异，具有可比性，见表1。本研究经贵州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，批准号(2016)伦审第(S119)号。
| 组别 | 年龄/岁 | 睾酮/nmol·L-1 | 催乳素/nmol·L-1 | 体质量指数/kg·m2 |
|---|---|---|---|---|
| 观察 | 29.37±4.05 | 2.29±0.96 | 0.59±0.17 | 24.27±3.25 |
| 对照 | 30.06±4.14 | 1.92±0.83 | 0.61±0.20 | 23.36±3.19 |
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准
参照中华医学会妇产科分会推荐的2003年鹿特丹多囊卵巢综合征的诊断[11]，①稀发/无排卵；②具有多毛、痤疮、肥胖、雄激素升高等高雄激素的临床表现；③超声示多囊卵巢改变。3项中符合2项，并排除雄激素分泌性肿瘤等病因所致。
1.2.2 中医诊断标准
中医肾阳虚诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》[12]及《中医妇科学》[13]有关肾阳虚证PCOS的中医诊断标准。主证为畏寒肢冷，腰膝以下尤甚；腰膝酸软。次证为性欲淡漠；面色晄白或黧黑；小便清长，夜尿多；大便不实。舌脉为舌淡胖，苔白，脉沉细弱。凡具备主证及2项次证者并参照典型舌脉即可诊断。
1.3 纳入标准
①经相关检查，符合中西医诊断标准；②年龄在20～40岁患者；③无精神意识障碍；④生殖道无器质性病变；⑤近3个月内未使用过影响内分泌的药物和避孕药者；⑥治疗前1个月及治疗中均未服用其他中药制剂；⑦签署知情同意书，并完成规定疗程者。
1.4 排除标准
①近3个月内有使用激素类药物治疗者；②对治疗的相关药物成分过敏者；③伴肝功能或甲状腺、肾上腺等疾病者；④合并盲、聋哑、智力和精神障碍等者；⑤合并IR的PCOS患者；⑥其他引起排卵障碍疾病者，如高泌乳素血症等。
1.5 治疗方法
1.5.1 对照组
患者入院后，先行血、尿、便常规、肝肾功能等检查，对照组使用炔雌醇环丙孕酮片(上海信谊天平药业有限公司，国药准字H20094005，2 mg/片)口服治疗，每片含醋酸环丙孕酮2 mg和炔雌醇35 μg，1次/d，1片/次，月经第5天开始服用。
1.5.2 观察组
观察组在对照组的基础上联合温肾助阳调周法治疗，以暖宫助孕汤为基础，行调周法加减药味。组成：旱莲草10 g，女贞子10 g，淫羊藿10 g，仙茅30 g，巴戟天15 g，补骨脂10 g，鹿角霜15 g，锁阳10 g，所有中药饮片全部来自于贵州中医药大学第一附属医院中药房，由该院副主任药师罗军鉴定均为正品。分3期用药，经后期(月经周期第5～10天)辅以滋肾阴、益精血之品，加淮山药与熟地黄各15 g，当归10 g；经间期(月经周期第11～15天)辅以化瘀通络之路路通与皂角刺各10 g，刘寄奴12 g，以排卵助孕；经前期(月经周期第16～28天)辅以温补肾阳之桑寄生与续断各10 g，以助孕卵着床。中药煎服法，水煎，每日1剂，早中晚分服，每次100～150 mL；于月经第5天开始服(闭经患者于孕激素撤药出血第5天开始服)，服至月经来潮，经期停药，两组均连服3个月经周期(如果妊娠者停止治疗)。
1.6 观察指标
1.6.1 标本采集
采用统一的CRF临床观察表收集资料，患者签署知情同意后，于月经第2～4天或闭经时和采用温肾助阳调周法治疗结束后的下1个月经周期经期2～4 d，取空腹静脉血测定性激素、血糖、胰岛素水平，诊刮时留取适量新鲜子宫内膜组织于无菌冻存管中，-70 ℃冰箱保存备用。
1.6.2 血清激素水平测定
采集空腹肘静脉血10 mL，送贵州中医药大学第一附属医院特检科检验，性激素[卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，雌二醇(E2)，催乳素(PRL)，睾酮(T)]均采用电化学发光法。试剂盒均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，批号分别为171129，180417，180313，180109，171214。
1.6.3 相关指标测定
测空腹血糖(FPG)及空腹胰岛素(FINS)，用葡萄糖氧化酶法测定FPG，试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司，批号ER1721；用放射免疫法测定FINS，试剂盒购自深圳拉尔文生物工程技术有限公司，批号20161208；应用稳态模型评估法检测HOMA-IR，血清脂联素检测应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司，批号XF-HUMAN-1631，进而评价IR。
1.6.4 B超监测
应用G50型彩色多普勒超声诊断仪(德国西门子公司)监测患者卵巢，子宫内膜变化，排卵情况。
1.6.5 不良反应监测
主要包括肝肾功能异常、恶心、呕吐、头晕等不良反应。
1.7 标本采集和PI3K/Akt通路蛋白表达检测
蛋白印迹法检测子宫内膜Akt，p-Akt蛋白的表达，Akt，p-Akt兔源多克隆抗体(美国CST公司，批号1894)，β-肌动蛋白(β-actin)兔源多克隆抗体(美国Abeam公司，批号ab4054)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(美国Zymed Laboratories公司，批号40385461)。Trans-Blot Turbo型转膜仪(美国Bio-Rad公司)，Multiphor Ⅱ型多功能电泳仪(瑞典Pharmacia Bio Tech公司)，Alpha Innotech Corporation 5500型自动凝胶成像分析系统(美国Alpha Innotech Corp公司)。细胞裂解液冰浴下提取子宫内膜的总蛋白，并测定总蛋白的浓度。电泳上样量为总蛋白50 μg。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)采用10%分离胶恒压120 V分离目的蛋白；恒流300 mA转膜1 h；含5%脱脂奶粉的TBST溶液4 ℃封闭过夜；一抗(1∶1 000) 4 ℃摇床过夜；二抗(1∶5 000)室温下摇床孵育1 h。增强化学发光(ECL)试剂盒发光，暗室曝光显影；全自动凝胶成像系统照相并分析条带的灰度值，检测指标与内参灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
1.8 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料以
2 结果
2.1 两组患者治疗前后性激素水平比较
与本组治疗前比较，两组治疗后FSH，LH水平均明显降低，E2水平明显升高(P<0.05)；治疗后观察组患者FSH，LH水平均低于对照组，E2性激素水平高于对照组(P<0.05)。见表2。
| 组别 | 时间 | FSH/U·L-1 | LH/U·L-1 | E2/ng·L-1 |
|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 5.06±1.21 | 11.80±5.86 | 47.62±16.43 |
| 治疗后 | 3.72±1.011，2) | 8.01±4.361，2) | 92.28±23.691，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 5.13±1.06 | 12.09±6.07 | 47.51±16.47 |
| 治疗后 | 4.91±2.821) | 11.68±4.511) | 78.92±22.031) |
2.2 两组患者FPG与FINS水平比较
与本组治疗前比较，两组治疗后FPG，FINS均明显降低(P<0.05)；治疗后，观察组FPG及FINS水平均低于对照组(P<0.05)。见表3。
| 组别 | 时间 | FPG | FINS |
|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 8.06±1.19 | 12.05±2.06 |
| 治疗后 | 6.04±1.101，2) | 7.46±2.141，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 8.12±1.21 | 12.12±2.11 |
| 治疗后 | 7.13±1.181) | 10.02±2.031) |
2.3 两组患者IR情况比较分析
与本组治疗前比较，两组治疗后HOMA-IR及血清脂联素均明显降低(P<0.05)；治疗后观察组HOMA-IR及血清脂联素明显低于对照组(P<0.05)。见表4。
| 组别 | 时间 | HOMA-IR/μg·L-1 | 血清脂联素/mg·L-1 |
|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 2.39±0.27 | 10.31±1.20 |
| 治疗后 | 1.19±0.181，2) | 6.37±0.981，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 2.38±0.30 | 10.27±1.19 |
| 治疗后 | 2.01±0.321) | 8.02±1.091) |
2.4 两组患者卵巢体积、数目及子宫内膜厚度情况比较
与本组治疗前比较，两组治疗后卵巢体积、窦卵细胞数目均明显降低，子宫内膜厚度增加(P<0.05)；治疗后观察组卵巢体积、窦卵细胞数目明显低于对照组，子宫内膜厚度明显大于对照组(P<0.05)。见表5。
| 组别 | 时间 | 卵巢体积/V·mL-1 | 窦卵细胞数目/个 | 子宫内膜厚度/L·mm-1 |
|---|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 14.08±0.51 | 15.17±0.68 | 5.51±0.09 |
| 治疗后 | 7.28±0.421，2) | 4.20±0.571，2) | 9.96±0.211，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 13.89±0.49 | 15.04±0.71 | 5.48±0.08 |
| 治疗后 | 9.37±0.351) | 7.59±0.711) | 7.42±0.091) |
2.5 两组患者子宫内膜Akt及p-Akt蛋白表达比较
与本组治疗前比较，两组治疗后子宫内膜Akt，p-Akt蛋白均明显降低(P<0.05)；治疗后观察组子宫内膜Akt和p-Akt明显低于对照组(P<0.05)。见图1，表6。
| 组别 | 时间 | Akt/β-actin | p-Akt/β-actin |
|---|---|---|---|
| 观察 | 治疗前 | 72.18±17.19 | 61.06±14.48 |
| 治疗后 | 52.14±11.341，2) | 38.73±9.621，2) | |
| 对照 | 治疗前 | 73.39±17.72 | 60.38±14.15 |
| 治疗后 | 63.32±10.521) | 47.38±9.311) |
2.6 两组不良反应比较
在治疗过程中，两组均未出现严重不良反应。
3 讨论
PCOS属于稀发排卵或无排卵、高雄激素或IR，多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的综合征，其发病率为5%～10%。以高雄激素、持续无排卵及多囊卵巢为特征[14]。目前单纯应用西药促排卵类药物促排卵，以提高妊娠率，但其质量差，妊娠率低，流产率高，如炔雌醇环丙孕酮片其作用机制主要抑制促性腺激素过多分泌，减少雄激素的合成与分泌，促进月经的恢复和规律，但长时间应用不良反应较多，且停药后易复发[15-17]。PCOS严重影响患者的身心健康，对于育龄期妇女而已，PCOS所致不孕是其重要的致病后果，关系患者的家庭婚姻生活[18]。根据有关学者研究认为中西医结合具有促排卵率高，受孕率高，流产低等优势，得到广泛应用和认可[19]。
在中医学上，将肾阳虚证PCOS归属为“月经病”“不孕”，认为导致PCOS的主要原因是肾虚，以肾阳虚为主要特点[20]，治疗上提出以温肾助阳调周法主治月经不调肝郁肾虚证，可通过多途径、多靶点、多层次的作用于PCOS患者体内的多个环节，促进机体恢复正常的胰岛素代谢水平，调节PI3K/Akt信号通路，进而减轻IR，改善改善PCOS患者体内生殖激素紊乱、提高排卵质量及子宫内膜厚度等内环境。该方组分包含旱莲草、女贞子、淫羊藿、仙茅、巴戟天、补骨脂、鹿角霜、锁阳，经药理学研究表示方中旱莲草可滋阴益肾，凉血止血，尤其是肾阴亏虚，阴虚血热而致出血患者适用，女贞子可滋补肝肾、明目乌发，淫羊藿补肾壮阳、祛风除湿、强筋健骨，仙茅具有温脾止泻、强筋健骨、温肾壮阳的作用，巴戟天可降压、强健筋骨、补肾壮阳，补骨脂温肾助阳、止泻纳气，鹿角霜有补肾助阳，收敛止血的功效，锁阳可补肾、益精、润燥，诸药合用可温补肾阳、疏肝活血、健脾化湿，共奏调经助孕的功效[21]。
PCOS存在的IR，是导致高胰岛素血症、子宫内膜异常增生的关键环节，因此，如何有效的改善IR，促进PCOS宫内环境的稳定性，是育龄期PCOS患者治疗的关键点[22]。PCOS患者子宫内膜存在胰岛素受体的表达，胰岛素PI3K/Akt通路参与调节细胞增生和子宫内膜细胞稳定性，PI3K通路障碍是PCOS产生IR的主要原因，当PI3K激活后可变构并激活依赖磷酸酰肌醇的激酶，使靶蛋白Akt被激活，胰岛素具有促进子宫内膜细胞增殖及子宫内膜癌细胞增殖的作用，胰岛素受体β亚基的酪氨酸激酶活化后，胰岛素受体底物被激活并进一步激活PI3K通路。作为PI3K下游的直接靶蛋白，当PI3K激活后，Akt多个残基的磷酸化位点发生磷酸化进而激活Akt，磷酸化而激活的Akt能够促进卵泡膜细胞增生、卵泡发育异常或无排卵等PCOS临床症状的产生[23]。Akt信号通路主要负责由PI3K启动的生物信息的传导，Akt处于这一通路的中心环节，在细胞代谢、周期变化及增殖等生物学过程中起到了不可缺少的作用，与IR的发生发展密切相关。PI3K，p-Akt在有IR的患者子宫内膜中表达异常升高，从而达到抑制子宫内膜异常增生及癌变的目的，胰岛素PI3K/Akt通路参与调节细胞增生和子宫内膜细胞稳定性，其途径的活化促进了子宫内膜癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡，IR的PCOS患者子宫内膜组织中p-Akt蛋白的表达水平高于非IR者，且在PCOS患者复杂的内分泌代谢环境中，胰岛素PI3K/Akt信号通路的过度活化即p-Akt的过度表达参与了PCOS子宫内膜异常增生及癌变的发生和发展过程，该通路被认为是公认的糖代谢经典通路，被认为是PCOS产生糖耐量异常的主要机制，进一步证明了PCOS患者子宫内膜存在异常的胰岛素信号通路的表达。本研究治疗后两组患者的HOMA-IR及血清脂联素较治疗前均有明显下降，然观察组患者IR指标下降的程度明显大于对照组；观察组患者子宫内膜PI3K，Akt，p-Akt明显高于对照组，同上述观点一致。IR主要是通过PI3K/Akt信号通道途径对靶点器官、组织实现IR，IR发生在胰岛素信号传导途径中的任何一环节受损，子宫内内膜异常改变是基于PCOS的存在[24]。颗粒细胞PI3K/Akt通路活性减弱可降低糖吸收利用能力，使糖代谢异常，并可影响卵泡及窦卵泡生长发育，引起排卵异常。
本研究两组治疗后的FSH，LH水平均下降，E2性激素水平上升，且观察组患者的FSH，LH水平均低于对照组，E2性激素水平高于对照组；治疗后，观察组患者FPG，FINS水平下降程度明显大于对照组；且观察组患者胰岛抵抗指标下降的程度明显大于对照组；观察组患者子宫内膜PI3K，Akt，p-Akt明显高于对照组，证实中医方法治疗PCOS临床疗效显著，且有效调控PI3K/Akt信号通道的正常有序表达，但因中医药治疗方法不一，效果作用机制不一，不利于临床推广应用，仍需进一步深入探讨。
综上所述，采用温肾助阳调周法可有效的改善肾阳虚证PCOS患者性激素水平，调控胰岛素，促进卵巢功能恢复，这可能与阻断Akt磷酸化，抑制PI3K/Akt信号通路活化有关。
