刺五加为五加科五加属多年生木本植物[1]。据2015年版《中国药典》记载刺五加以干燥的根和根茎或茎为药用部位[2]。具有益气健脾，补肾安神的功效[2]。主要分布于黑龙江、吉林、辽宁的东部地区[1]。种植刺五加是刺五加产业发展的基础，但在种植刺五加的过程中却出现了多年种植刺五加的土地影响刺五加正常生长的状况。
植物-土壤反馈是指植物改变根际土壤的生物和非生物特征，同时提高或降低植物生长，从而影响植物群落组成及植物间的相互作用[3]。Kardol等[4]研究显示植物-土壤反馈可以对植物个体产生巨大的变化。Dudenhöffer等[5]的研究显示植物-土壤反馈可改变植物的物质分布，甚至可对植物生长发育产生跨带效应，而不同植物生长阶段植物-土壤反馈差别巨大。Kulmatiski等[6]发现对植物-土壤反馈的研究多以生物量、株高及种子萌发等指标进行衡量。近几年，植物-土壤反馈研究逐渐增加，但试验方法还不太成熟[7]，研究方法比较散乱，且目前对中草药在植物-土壤反馈方面的研究并不多，如YANG等[8]采用在土壤中蒸煮后添加生物炭的方法解决了植物-土壤负反馈对三七种植过程中的严重影响，García-Parisi等[9]从丛枝菌根角度探讨了丛枝菌根和内生真菌在同一草本种群植物-土壤反馈中的作用，周光姣等[10]分析了亳白芍药材质量和其中无机元素含量与土壤无机元素含量的相关性。
植物中的活性氧(ROS)是植物有氧代谢的产物，是参与调控植物的生理反应及非生物胁迫反应一个重要的信号[11]。植物通过抗氧化酶系统和抗氧化剂对ROS进行清除[12]。超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，过氧化物酶(POD)，抗坏血酸过氧化物酶(APX)等是抗氧化酶系统中控制植物体内ROS积累的最主要酶[13-14]。目前，多数植物抗氧化系统的研究集中在环境胁迫下对植物生长的影响，如光、水分、温度等。例如李强等[15]研究了不同光质对茅苍术生长、抗氧化酶活性及挥发油含量的影响，万春阳等[16]研究了氯化钠胁迫对甘草生长、生理及有效成分含量的影响。而影响植物抗氧化酶活性的因素众多，既有植物自身的因素，也包括各种各样的环境因子，如LIU等[13]研究了土壤干旱对沙棘幼苗光合特性及抗氧化酶活性的影响。
综上，本课题组推测多年生植物对土壤的改变可能会对后续植物幼苗的抗氧化酶系统产生影响。因此，本研究利用刺五加盆栽试验初步模拟土壤对刺五加幼苗生长影响，系统比较分析植物-土壤反馈对刺五加幼苗抗氧化酶系统的影响，从而为加深理解植物-土壤反馈对刺五加生长的影响提供研究基础，并为农田栽培刺五加技术标准提供理论依据和技术支持。
1 材料
2018年5月初，在伊春红星林业局中心苗圃选取连续3年生长刺五加的地块、黑龙江中医药大学药园选取多年生长刺五加的地块和未种植过刺五加的地块分别收集表层土壤50 kg，去除表面的枯枝落叶和碎石，用于室内盆栽试验。
同时在伊春红星林业局中心苗圃选取长势一致的刺五加1年生幼苗带回黑龙江中医药大学药园温室进行移栽。样品经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为五加科刺五加Acanthopanax senticosus。
AE240型电子天平(德国梅特勒-托利多国际有限公司)，Spectra Max M2型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)，Vortex 3000型漩涡振荡器(德国维根斯公司)，FS-1型可调高速匀浆机(上海比朗公司)，H1650型台式微量高速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，SPAD-502Plus型叶绿素计(Konica Minolta公司)，0～150 mm游标卡尺(无锡锡工量具公司)。
ACP测试盒(微量酶标)(批号20180816)，SOD测定试剂盒(WST-1法)(批号20180815)，CAT测试盒(可见光法)(批号20180815)，POD测试盒(测植物)(比色法)(批号20180814)，APX活性测定试剂盒(分光光度法)(批号20180817)，蛋白定量测试盒(BCA法)(批号20180815)，MDA测试盒(TBA法)(批号20170927)，均采购于南京建成生物工程研究所。
2 方法
2.1 试验设计
以收集的多年栽培刺五加的土壤和未栽培过刺五加的土壤为栽培基质，分别去除表面的枯枝落叶和碎石后，选取长势一致的刺五加1年生幼苗，分别移栽到装有黑龙江中医药大学药园采集的未种植过刺五加的土壤(1组)，伊春红星林业局中心苗圃采集的连续3年生长刺五加的土壤(2组)，黑龙江中医药大学药园采集的多年生长刺五加的土壤(3组)，共计3组，每组12盆，共计36盆。所有盆放置在黑龙江中医药大学温室中，每周随机调换位置，每周浇水一次，温室栽培4个月后进行相关指标测定。
2018年5月中旬和8月末，测定刺五加株高和叶色值(SPAD)。2018年8月末，采集新鲜的刺五加叶片按照相应试剂盒操作说明对样品进行蛋白，ACP，SOD，CAT，POD，APX，MDA测定。2018年9月末，幼苗全株收获，用自来水冲净后，用滤纸吸干表面水分，测定植株鲜重和地径，然后放入35 ℃的烘箱中烘干，测定植株干重，计算干鲜比、根冠比和苗木质量指数[苗木质量指数＝苗木总干物质量/(苗高/地径＋茎干物质量/根干物质量)×100%][14]。
2.2 数据分析
采用蛋白质，ACP，SOD，CAT，POD，APX，MDA酶活性值分别对刺五加幼苗的抗氧化酶系统变化进行描述，同时用干鲜比，根冠比，株高，SPAD，苗木质量指数对刺五加幼苗的生长进行描述。试验数据均采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，通过单因素方差分析(One-way ANOVA)对数据进行分析。根据方差分析结果采用邓肯法(Duncan)对数据进行多重比较。
3 结果与分析
3.1 对刺五加幼苗生物量和生长的影响
不同组之间刺五加幼苗的生物量有显著性差异，但叶的干重无显著性差异，见表1。多年生长刺五加的土壤对刺五加幼苗株高产生显著影响，但多年生刺五加的土壤和3年生刺五加的土壤对刺五加幼苗株高没有显著影响。未种植过刺五加的土壤对提高刺五加幼苗的SPAD含量影响显著，且随着刺五加生长年份的增加影响显著。不同组之间刺五加幼苗的干鲜比、根冠比、地径和苗木质量指数均有显著性差异。见表2。
| 组别 | 整株鲜重 | 根鲜重 | 茎鲜重 | 叶鲜重 | 整株干重 | 根干重 | 茎干重 | 叶干重 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 4.869 5±1.175 7b | 3.471 4±1.277 8b | 0.722 5±0.233 4b | 0.675 5±0.275 8a | 4.083 1±0.783 9b | 2.886 5±0.941 8b | 0.607 8±0.176 9b | 0.588 7±0.283 2a |
| 2 | 1.741 3±0.230 4a | 0.981 9±0.230 2a | 0.123 5±0.123 7a | 0.635 9±0.135 0a | 1.651 7±0.194 9a | 0.930 3±0.205 1a | 0.115 8±0.115 4a | 0.605 6±0.134 4a |
| 3 | 4.651 3±0.625 5b | 3.094 0±0.616 2b | 0.810 1±0.083 8b | 0.847 2±0.012 9b | 3.746 8±0.701 5b | 2.712 3±0.426 7b | 0.683 0±0.075 3b | 0.718 0±0.019 4a |
| 组别 | 干鲜比 | 根冠比 | 株高/cm | SPAD | 地径/mm | 苗木质量指数/% |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.850 4±0.056 7a | 2.633 4±1.205 8b | 10.9±0.5b | 36.6±2.4c | 5.01±0.32b | 1.725 3±0.438 5b |
| 2 | 0.950 3±0.014 0b | 1.296 8±0.321 8a | 7.3±0.5a | 34.1±1.9b | 3.97±0.60a | 0.842 6±0.185 5a |
| 3 | 0.853 1±0.019 2a | 1.890 5±0.488 2a | 7.1±0.6a | 25.7±2.0a | 5.73±0.73c | 2.538 0±0.772 4c |
3.2 对刺五加抗氧化酶系统的影响
根据试验设计方案，得到刺五加抗氧化酶系统中蛋白质，ACP，SOD，CAT，POD，APX，MDA酶活性值，见表3。
| 分组 | 蛋白质/mg·g-1 | MDA/nmol·g-1 | CAT/U·g-1 | ACP/U·g-1 | APX/U·g-1 | POD/U·g-1 | SOD/U·g-1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3.010±0.338a | 1.665±0.232b | 39.742±4.766b | 66.332±38.986a | 0.040±0.026a | 22.915±0.900b | 401.308±129.004c |
| 2 | 4.150±0.634b | 1.331±0.333a | 29.176±3.041a | 56.887±30.971ab | 0.084±0.011b | 15.933±2.728a | 245.686±59.975b |
| 3 | 3.234±0.839a | 1.486±0.280ab | 38.853±9.627b | 97.174±49.927b | 0.111±0.029c | 20.215±9.280ab | 162.120±75.582a |
3.2.1 对刺五加植株蛋白含量影响
不同土壤对刺五加幼苗中蛋白含量有显著性差异。从表3可以看出，连续3年生长的刺五加的土壤中刺五加幼苗蛋白质含量最高，未种植过刺五加的土壤中刺五加幼苗蛋白质含量最低，但多年生长刺五加的土壤和未种植过刺五加的土壤中刺五加幼苗的蛋白质含量无显著性差异。
3.2.2 对刺五加植株MDA含量的影响
MDA反映了植物细胞受到自由基攻击的严重程度。不同土壤对刺五加幼苗中MDA含量有显著性差异。从表3可以看出，未种植过刺五加土壤的刺五加幼苗MDA含量最高，连续3年生长刺五加的土壤中刺五加幼苗MDA含量最低，但多年生长刺五加的土壤中刺五加幼苗MDA含量和其他两组无显著性差异。
3.2.3 对刺五加植株SOD活性的影响
SOD活性作为植物抗氧化酶系统防御的第一条线，反映了植物清除氧自由基的能力[13]。不同土壤对刺五加幼苗中SOD活性有显著性差异。未种植过刺五加土壤的刺五加幼苗SOD活性最高，多年生长的刺五加土壤的刺五加幼苗SOD活性最低。
3.2.4 对刺五加植株CAT活性的影响
CAT主要存在于过氧化体中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系[14]。不同土壤对刺五加幼苗中CAT活性有显著性差异。未种植过刺五加土壤的刺五加幼苗CAT活性最高，连续3年生长刺五加土壤的刺五加幼苗CAT活性最低。但多年生长刺五加的土壤和未种植过刺五加的土壤刺五加幼苗的CAT活性无显著性差异。
3.2.5 对刺五加植株POD活性的影响
POD的活性能够反映植物对H2O2等活性氧的清除能力[15]。不同土壤对刺五加幼苗中POD活性有显著性差异。未种植过刺五加土壤的刺五加幼苗POD活性最高，连续3年生长刺五加土壤的刺五加幼苗POD活性最低。但多年生长刺五加的土壤的刺五加幼苗POD活性和其他两组无显著性差异。
3.2.6 对刺五加植株APX活性影响
APX是植物清除H2O2的关键酶[16]。不同土壤对刺五加幼苗中APX活性有显著性差异。未种植过刺五加土壤的刺五加幼苗APX活性最低，多年生长的刺五加土壤的刺五加幼苗APX活性最高。
3.2.7 对刺五加植株ACP活性影响
不同土壤对刺五加幼苗中ACP活性无显著性差异。多年生长的刺五加土壤的刺五加幼苗ACP活性最高，连续3年生长刺五加土壤的刺五加幼苗ACP活性最低。
4 讨论
目前，判定植物-土壤反馈作用强度和方向主要通过测定供试种生物量、株高及种子萌发等情况[17]。而作物叶子中的叶绿素含量可作为作物自身整体状况的一个指标，一般而言作物越健康，其叶绿素含量越高。本实验结合实际情况采用了测定生物量、株高和SPAD的方法，结果表现为植物-土壤反馈体系中的负反馈作用，即生长过刺五加的土壤不利于刺五加幼苗的种植和生长。
未种植过刺五加的土壤的刺五加幼苗MDA含量，CAT活性，POD活力和SOD活力要高于种植过刺五加的土壤的刺五加幼苗，而蛋白质含量和APX活性要低于种植过刺五加的土壤的刺五加幼苗，但ACP活力则介于连续3年生长刺五加的土壤和多年生长刺五加的土壤的刺五加幼苗之间。连续3年种植刺五加的土壤的刺五加幼苗的蛋白质含量和SOD活性要高于多年种植刺五加的土壤的幼苗，但MDA，ACP，CAT，APX，POD活性要低于多年生长刺五加的土壤的幼苗。说明种植过刺五加的土壤在刺五加幼苗生长过程中导致植物体内产生大量活性氧、自由基，引发膜脂过氧化作用，损伤膜的正常结构和功能。从种植刺五加土壤的种植年份来看(0年，3年，多年)，蛋白质呈现中间高两边低的趋势，MDA，CAT，POD呈现“V字型”，APX呈现上升趋势，SOD呈现下降趋势。这可能是由于抗氧化酶活性之间的平衡是超氧自由基和H2O2的稳态水平的关键，SOD能特异性的歧化为H2O2和O2，然后由APX，CAT，POD清除H2O2，APX，CAT和POD属于不同的H2O2清除酶类别[12，18-28]。
综上所述，本研究是在温室可控的条件下研究了植物-土壤反馈对刺五加幼苗抗氧化酶系统的影响，试验周期较短，只观察了1年生刺五加幼苗一个生长季的生长情况。由于植物生长受到多因素的调控，抗氧化酶系统只是对研究植物-土壤反馈试验方法的初探，在研究其抗氧化酶系统活性变化的同时还应考察其生物量、光合作用、有效成分含量变化、土壤微生物、丛枝菌根等，才能更加准确分析。本试验初步比较分析了植物-土壤反馈对刺五加幼苗抗氧化酶系统的影响，为加深理解植物-土壤反馈对刺五加生长的影响提供研究基础，并为农田栽培刺五加技术标准提供理论依据和技术支持。
