刺五加为五加科五加属植物[1]，以干燥的根和根茎或茎入药，性温，味辛、微苦，归脾、肾、心经，常用于益气健脾，补肾安神，脾肺气虚，食欲不振，肺肾两虚，肾虚腰膝酸痛，心脾不足，失眠多梦[2]，同时具有很好的抗氧化作用[3]。刺五加主要产于中国、俄罗斯、日本、朝鲜等国[4]，大、小兴安岭，长白山，燕山山脉，太行山和秦岭山脉是我国野生刺五加主产区[5]。刺五加在治疗风湿病、冠心病、心绞痛、脑梗死等疾病中疗效显著。以其为主原料的功能保健型绿色食品及保健品畅销于国内外，是我国出口的主要中药材之一。但我国野生刺五加蕴藏量很小，在巨大的市场需求下野生刺五加遭遇了几十年的野蛮地毯式采挖，种群日渐濒危，早已被作为渐危植物列入《中国植物红皮书—稀有濒危植物(第一册)》中[6]。野生状态下刺五加有性繁殖成功率极低，自我更新困难[7]，刺五加药材由野生转为人工栽培是必然趋势，然而我国21世纪初才开始人工培育刺五加[8]，且国内外对其栽培技术、管理技术鲜少研究，本课题组在考察黑龙江省17个刺五加种植基地后发现刺五加幼苗存在生长过于缓慢，病害高，无科学管理方法等问题，基本属于“靠天养”，这严重遏制了其产业发展和经济效益。
氮素是植物所必须的大量元素[9]，是组成植物体内蛋白质、叶绿素、肽类、核酸、辅酶、维生素、激素和细胞膜的重要成分。科学合理施用氮肥能够维持土壤肥力，提供苗木、林木生长所需营养[10-11]，促进苗木生长，提高苗木产量和质量[12]。已有报道收集了药用植物化肥施用的科学数据[13-14]，证明了合理施用肥料不但可以提高产量和质量，还可以提高次生代谢产物含量。不合理施用会形成逆境胁迫环境，影响植物的生长，打破植物生理稳态造成细胞内活性氧过量产生[15]，氧化植物体内脂质、蛋白质、核酸[16]。植物通过调节自身抗氧化系统来有效消除和减少活性氧，研究显示氮胁迫条件下羌活[17]，玉米等植物通过增加抗氧化酶活性缓解活性氧离子对细胞膜脂过氧化作用以保证植物正常生理功能[17-18]。
目前关于刺五加科学施肥管理的研究很少。本实验测定了不同施氮量处理下刺五加幼苗生长发育状况和抗氧化酶过氧化氢酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，酸性磷酸酶(ACP)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的酶活性的变化，以揭示刺五加抗氧化酶系统对不同施氮量的反应和适应机制，为刺五加高产、高质量栽培提供科学依据。
1 材料
刺五加实生苗采于黑龙江省伊春市红星林业局，由黑龙江中医药大学药王振月教授鉴定为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus。试验在黑龙江省哈尔滨市黑龙江中医药大学药用植物园进行。
AE240型电子天平(德国梅特勒公司)；Spectra Max M2型微孔板检测系统(美国美谷公司)；FS-1型可调高速匀浆机(上海比朗公司)。
尿素(CON2H4，山东润银生物化工股份有限公司，GB 2440-2001，含N量46%)。
A060-2型硝酸磷酸酶ACP测定试剂盒(微板法，批号20180526)；A001-3型总超氧化物歧化酶SOD测定试剂盒(wst-1法，批号20180315)；A007-1-1型过氧化氢酶CAT测定试剂盒(可见光法，批号20180415)；A084-3型过氧化物酶POD测定试剂盒(测植物)(比色法，批号20180521)；A123型抗坏血酸过氧化物酶APX测试盒(紫外比色法，批号20180719)；A045-4型总蛋白TP测定试剂盒(带标准：BCA法，批号20180713)；A003-1型丙二醛MDA测定试剂盒(TBA法，批号20180320)，所有试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
2 方法
2.1 实验设计
以刺五加幼苗为实验材料进行为期一年田间试验，试验田位于黑龙江中医药大学药用植物园内，面积约130 m2。2018年4处平整土地，划分18个实验小区，小区间以PVC板和聚乙烯膜进行隔离。5月初于刺五加繁殖基地采购供试种苗，供试种苗单株长(12.73±1.54)cm，根长(6.25±1.44)cm，茎粗(0.57±0.15)cm，分枝数1个，芽为嫩绿色，芽长(0.58±0.21)cm，移栽于实验小区，下种量为1.5 t·m-2，株距0.4 m。待95%以上幼苗长出第二片新叶后以不同施氮量进行处理，其他田间生产管理措施均按当地实际生产措施进行，适时防治病虫害，并于拔节期追施氮肥，9月中旬全部采收。
本试验为单点(植物营养研究方法)单因素试验，共设6个施氮量处理，分别为CK(0 g·m-2)组，N1处理组(30 g·m-2)，N2处理组(60 g·m-2)，N3处理组(90 g·m-2)，N4处理组(120 g·m-2)及N5处理组(150 g·m-2)，每处理组重复3次。每组缓苗期后施加氮肥总量60%，拔节期施加40%。
2.2 生物量指标测定
每处理组随机挑选12株刺五加幼苗冲洗干净，用滤纸吸干水分，将每株幼苗的根、茎和叶区分开，用电子天平称重法分别称量，分别装入档案袋中，于105 ℃烘箱中杀青30 min，然后在75～80 ℃下烘干至恒重，冷却后使用电子天平称重测定干物质含量。计算地上干鲜重和地下干鲜重，根冠比＝地下干重/地上干重，折干率＝干重/鲜重×100%。
2.3 抗氧化酶活力测定
每个处理组及重复组随机挑选12株刺五加苗冲洗干净，摘取第二层鲜叶，进行测定抗氧化酶活性，采用SOD，POD，CAT，APX，ACP，MDA和蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定，按照说明书流程严格操作，各指标重复测定3次。
2.4 数据处理
试验数据采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析，通过单因素方差分析(One-wayANOVA)，LSD和Dunnett's-T法多重比较对比数据差异显著性，差异显著定义为P<0.05；采用Excel绘制表格。所有数据均用
3 结果与分析
3.1 不同施氮量对刺五加植株生物量影响
不同施氮量处理对刺五加植株生物量影响见表1。整株鲜重、地下部分鲜重、整株干重、地上部分干重和地下部分干重最大值均出现在N4处理组中，分别为8.87，6.00，3.32，1.18，2.14 g/株，分别比CK组增加285.65%，287.09%，395.52%，391.67%，397.67%，地上部分鲜重和折干率最大值均出现在N5处理组中，分别为2.99 g/株和33.01%，分别比CK组增加298.66%和37.5%。施氮后各处理组刺五加植株生物量各指标均高于CK组。所有处理组中刺五加生物量指标组间差异达显著水平。随着施氮量增加植株整株鲜重、整株干重、地上部分干重、地下部分干重均呈现先升再降再升再降的变化趋势，地下部分鲜重与折干率呈现先升后降再升的变化规律，整株干重呈现先升后降的变化规律，地上鲜重呈现一直增加的变化趋势。
| 组别 | 整株鲜重/g/株 | 地上部分鲜重/g/株 | 地下部分鲜重/g/株 | 整株干重/g/株 | 地上部分干重/g/株 | 地下部分干重/g/株 | 折干率/% |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 2.30±0.18abc | 0.75±0.09ab | 1.55±0.19abcd | 0.67±0.06abc | 0.24±0.04acd | 0.43±0.02abcd | 24.51±1.42abcd |
| N1 | 5.07±0.81abc | 1.65±0.33ab | 3.42±0.81a | 2.03±0.01a | 0.79±0.12a | 1.24±0.11a | 34.57±1.50 |
| N2 | 3.64±0.59ab | 1.50±0.13ab | 2.14±0.33abd | 2.07±0.28abc | 0.25±0.11abcd | 0.82±0.18abcd | 26.69±0.47abcd |
| N3 | 5.36±0.45abe | 1.70±0.27ab | 3.61±0.51a | 2.13±0.10a | 0.69±0.04ab | 1.44±0.06a | 32.71±0.61 |
| N4 | 8.87±1.15 | 2.87±0.90 | 6.00±0.17 | 3.32±0.35 | 1.18±0.18 | 2.14±0.17 | 32.36±0.91 |
| N5 | 7.49±1.03 | 2.99±0.06 | 4.49±0.69cda | 2.48±0.48a | 1.01±0.06 | 1.47±0.43a | 33.01±1.84 |
3.2 不同施氮量对刺五加植株蛋白质含量的影响
不同施氮量对刺五加幼苗体内蛋白质含量影响见表2。由表2可知，除N1处理组幼苗蛋白质含量低于CK组外其余处理组蛋白质含量均高于CK组，随着各组间施氮量的递增植株体内蛋白质呈现迅速升高的趋势，并在N3(90 g·m-2)处理下蛋白质含量最大后，随着施氮量继续增大蛋白质含量逐渐降低。
| 组别 | 蛋白质/mg·g-1 | CAT/nmol·g-1 | POD/nmol·g-1 | APX/nmol·g-1 | SOD/nmol·g-1 | ACP/nmol·g-1 | MDA/nmol·g-1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 4.63±0.64 | 1.74±0.55 | 16.73±2.97 | 0.47±0.25 | 3 146.2±366.37 | 94.2±51.52 | 1.426±0.794 |
| N1 | 4.08±0.91 | 4.74±1.69 | 17.55±4.38 | 0.69±0.03 | 3 884.35±1 180.33 | 98.04±39.28 | 1.061±0.221 |
| N2 | 7.31±2.94 | 1.61±0.92 | 14.81±5.01 | 0.37±0.31 | 2 198.81±590.47 | 36.08±10.25 | 0.735±0.262 |
| N3 | 10.99±1.02 | 1.15±1.20 | 5.14±0.55 | 0.18±0.11 | 1 753.10±226.02 | 21.35±4.90 | 0.322±0.067 |
| N4 | 7.83±2.55 | 3.69±1.74 | 11.51±4.96 | 0.38±0.15 | 2 309.94±647.00 | 93.04±31.23 | 0.58±0.140 |
| N5 | 5.50±0.73 | 5.47±1.43 | 15.29±1.97 | 0.56±0.13 | 2 469.37±594.78 | 54.62±12.97 | 0.529±0.050 |
3.3 不同施氮量对刺五加植株CAT活性的影响
不同施氮量对刺五加幼苗植株CAT活力的影响见表2。由表2可知，除N2和N3处理组CAT活力低于CK组，其余各处理组CAT活力均高于CK组，N5处理组最高。随着各组间施氮量的递增植株CAT活力呈现逐渐降低的趋势，并在N3(90 g·m-2)处理下达到最小值后，随着施氮量增大CAT活力快速升高。
3.4 不同施氮量对刺五加植株POD活性的影响
不同施氮量对刺五加幼苗植株中POD的影响见表2。由表2可知，N2，N3，N4和N5处理组POD活力低于CK组，N1处理组最高，高于CK组。植株POD活力随着各组间施氮量增减呈现“V”型变化规律，即随着施氮量增加，植株POD活力先降低，N3(90 g·m-2)处理下达到最小值后显著升高。
3.5 不同施氮量对刺五加植株APX活性的影响
不同施氮量培养下刺五加植株体内APX活性的变化见表2，N2，N3，N4处理组APX活力低于CK组，其余各处理组APX活力均高于CK组，其中N1处理组最高。刺五加幼苗体内APX活力随着各组间施氮量的增加呈现逐渐降低的趋势，并在N3(90 g·m-2)处理下达到最小值后，随着施氮量增大APX活力快速升高。
3.6 不同施氮量对刺五加植株SOD活性的影响
不同施氮量培养下刺五加植株体内SOD活性的变化见表2，除N1处理组SOD活力高于CK组，其余各处理组SOD活力均低于CK组，其中，N1处理组最高。刺五加幼苗体内SOD活力随着各组间施氮量的增加呈现逐渐降低的趋势，并在N3(90 g·m-2)处理下达到最小值后，随着施氮量增大SOD活力呈现缓慢升高的趋势。
3.7 不同施氮量对刺五加植株ACP活性的影响
不同施氮量对刺五加幼苗植株体内ACP的影响见表2。由表2可知，N2，N3，N4和N5处理组ACP活力低于CK组，其中N1处理组ACP活力最高，高于CK组。随着各组间施氮量的递增植株ACP活力呈现逐渐降低的趋势，并在N3(90 g·m-2)处理下达到最小值后，随着施氮量增大ACP活力快速升高。
3.8 不同施氮量对刺五加植株MDA活性的影响
不同施氮量对刺五加幼苗植株体内MDA活力影响见表2。由表2可知，各处理组MDA活力均低于CK组，CK组MDA活力最高。植株体内MDA活力随着施氮量量增加呈现先降低后增加再降低的变化趋势。
4 讨论
4.1 不同施氮量对刺五加幼苗生长发育的影响
氮素对植物的生长发育至关重要，当施氮量适宜时，能促进植物体内蛋白质和叶绿素的合成，此时茎叶色泽深绿，植物体健壮，繁殖器官发育良好，产量明显增加，品质高[19]。缺氮时植物地上部和根系生长显著受到抑制，尤其是叶片表现显著。氮素过多导致植株营养体徒长，叶面积过大，叶片下互相遮阴，不利通风透光，植物体内可溶性非蛋白态氮含量和含水量过高，茎秆软弱，抗病虫能力弱，造成土壤氨挥发的増大，毒害根系，降低土壤水分的有效性[20]。本研究中，与CK组相比各施氮处理组刺五加幼苗生物量均显著增高，施氮量不同幼苗生理指标具有差异性，说明施氮能促进和调控刺五加幼苗生长发育。随着各处理组施氮量逐渐增大刺五加幼苗地上部营养体徒长，导致叶鲜生物量一直增加，N5(150 g·m-2)组叶面积最大。N4处理组刺五加幼苗的整株植株生物量以及地下部生物量达到最大值，说明氮素不足和过多都会不同程度抑制刺五加幼苗生物量的积累，适宜刺五加幼苗生物量积累的施氮量为N4(120 g·m-2)。
4.2 不同施氮量对刺五加幼苗抗氧化酶系统的影响影响
植物在逆境胁迫下体内会产生大量具有毒害作用的活性氧。植物通过促进抗氧化酶系统加强清除活性氧以维持正常生长。施氮量不足和过多时都会对植物产生不同的胁迫作用，造成抗氧化酶活性变化[21]。本研究发现，除N1处理组中植株体内蛋白质含量低于CK组，其余处理组均高于对照组，说明适宜的施氮量能提高刺五加植株体内蛋白质含量，施氮量为30～90 g·m-2促进植物体内蛋白质合成，进一步增加施氮量抑制体内蛋白质合成。随着施氮量增加CAT，APX，ACP活力均呈现两边高中间低的“V”型变化趋势，且低施氮量处理组的CAT，APX，ACP的活力要高于高施氮量处理组说明低施氮量和高施氮量都会对刺五加生长造成胁迫环境，低施氮量处理组植物所受的氧化伤害高于高施氮量处理组。除N3处理组刺五加植株体内POD活力较低外其余各处理组活力均很高，由此可以推断，刺五加植株体内POD活力受施氮量变化影响较大，而SOD活力随着施氮量显著降低到N3处理组后，随着施氮量增加SOD活力仅缓慢升高，说明SOD主要在氮素缺乏时提高活力将歧化为H2O2和O2。MDA是脂膜过氧化最重要的产物之一，能加剧膜损伤，反应膜系统受损程度以及植物抗逆性。低施氮量处理下刺五加幼苗膜受损严重，N3处理组膜受损情况最轻，低施氮量处理造成的氮胁迫情况较高施氮量处理严重。由刺五加抗氧化酶系统活力推断，适宜刺五加生长的施氮量为N3(90 g·m-2)。
综上所述，刺五加对施氮量存在剂量效应关系，适宜的施氮量有利于刺五加生长发育，低施氮量和高施氮量都不利于刺五加生长，都会对刺五加造成N胁迫环境。适宜刺五加生长的施氮量为90～120 g·m-2。
