肝纤维化是由于酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和胆汁淤积性肝病等多种因素诱导肝细胞和库普弗细胞(Kupffer细胞)分泌细胞因子、活性氧、趋化因子和生长因子等化合物刺激肝星状细胞(HSCs)活化，促进肝脏中细胞外基质(ECM)的过度积累，导致纤维性瘢痕形成的病理过程[1]。肝脏组织的正常结构遭到破坏，会诱导肝脏功能的失调，最终引发肝功能衰竭[2]。研究发现，肝纤维化是一个可逆的过程，早期接受有效的抗肝纤维化治疗可以防止或减缓进展为肝硬化甚至肝癌。近年来，国内外研究者发现，中药在抑制肝纤维化进展和促进肝纤维化逆转方面有着它独特的优势，并且很多研究从机制上肯定了其作用，因此，本文将近年来中药抗肝纤维化的作用机制及用于综述如下，以期为临床抗肝纤维化药物的研制选择参考。
1 抑制HSCs活化和诱导活化的HSCs凋亡
HSCs是肌成纤维细胞的前体，在纤维化肝脏中，静止的HSCs转化为肌成纤维细胞，促进ECM分泌，破坏肝组织正常结构，影响肝功能。研究认为HSCs的活化是肝纤维化发生发展的中心环节[3]，因此抑制HSCs活化和诱导活化的HSCs凋亡是治疗肝纤维化的有效方法。
1.1 抑制HSCs活化
HSCs活化可以诱导ECM的分泌，ECM蛋白在Disse空间中的逐步沉积导致ECM的密度和硬度增加。另外，基质组成从Ⅳ型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和层黏连蛋白转变为I型和Ⅲ型纤维胶原，刺激整合素信号通路诱导HSCs活化，并形成正反馈环，促进ECM分泌[4-5]。扩增的ECM也可通过结合生长因子如转化生长因子-β(TGF-β)，血小板衍生生长因子(PDGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，结缔组织生长因子(CTGF)等来促进HSCs增殖活化[6]。因此通过下调细胞生长因子含量可以有效抑制HSCs活化，减少ECM过度分泌，阻断肝纤维化的进展。
1.1.1 TGF-β1与HSCs活化
TGF-β1由肝细胞产生，是诱导肝纤维化最主要的细胞因子[7]。TGF-β1信号传导抑制HSCs凋亡，并诱导HSCs合成过量的纤连蛋白和I型，Ⅲ型和Ⅳ型胶原等基质蛋白[8]。另外，TGF-β1可以促进ECM产生并抑制其降解，诱导纤维形成[9]。在TGF-β/Smad传导途径中，TGF-β1通过与TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ)结合而启动细胞内信号传导，然后TGF-β1激活TGF-β受体I型(TβRI)激酶，导致SMAD2和SMAD3的磷酸化。随后，活化的SMAD2和SMAD3与SMAD4形成寡聚复合物，易位到细胞核中，与纤溶酶原激活抑制因子1(PAI-1)上94 bp的TGF-β反应区中两个相邻的Smad结合位点相结合而启动转录，从而增加ECM的沉积，导致纤维化形成[10-11]。TGF-β1除了诱导SMAD途径外，还可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，核转录因子-κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等途径促进HSCs活化，诱导肝纤维化的形成[12-13]。
近期研究显示中药及复方可通过抑制TGF-β1及其下游通路的表达有效抑制HSCs活化。安祯祥等[14]研究显示扶脾柔肝方下调肝组织TGF-β1，Smad3，Smad4 mRNA及蛋白表达水平，上调Smad7 mRNA及蛋白表达水平降低平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达，抑制HSCs活化，阻断肝纤维化的发展。张家富等[15]发现肝乐颗粒可以通过抑制TGF-β1的产生，阻断TβRI，Smad2蛋白的表达，抑制胶原纤维在肝脏的沉积，抑制肝纤维化的发生。李洁等[16]表示加味茵陈四逆汤可以显著抑制肝纤维化小鼠TβRI，Smad3 mRNA的表达，阻滞TGF-β1/Smads通路，抑制HSCs活化。郭会君等[17-18]研究发现柴竭抑肝纤可以通过干预TGF-β1/Smad信号通路，下调TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad4 mRNA表达，促进Smad7 mRNA表达，并且抑制HSC-T6细胞的增殖，保护TAA诱导的大鼠肝纤维化损伤。熊莎等[19]研究发现鳖甲提取物通过抑制TGF-β表达而抑制HSC-T6细胞增殖活化，并通过减少ECM的产生以及促进ECM的降解达到抗肝纤维化的效果。田新红等[20]发现柴胡疏肝散可以经TGF-β/p38 MAPK信号传导通路抑制HSCs活化，通过促进ECM降解减轻肝纤维化。
1.1.2 PDGF与HSCs活化
PDGF是一种能促进的HSCs高效有丝分裂的多肽生长因子，共包含PDGF-A，-B，-C和-D 4种亚基，这些亚基连接产生PDGF-AA，-BB，-AB，-CC和-DD 5种同源或异质生物聚合物[21-22]。其中PDGF-A，PDGF-B两种亚基通过二硫键连接可以形成PDGF-AA，BB和AB 3种同源或异源二聚体。PDGF受体(PDGFR)属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族，主要位于血管内皮细胞、成纤维细胞和库普弗细胞中[23]，PDGF具有PDGFR-α和PDGFR-β两种类型的受体，可以形成PDGFR-αα，-αβ和-ββ 3种亚型的二聚体。 PDGF-AA能够与受体PDGFR-αα结合控制核扩散和趋化作用的细胞，而PDGF-AB结合PDGFR-αα，PDGFR-αβ和PDGF-BB结合所有PDGFR-αα，-αβ和-ββ受体促进胶原合成和细胞黏附[21]。PDGF的底物磷脂酶Cγ(PLCγ)，Ras途径，PI3K以及信号转导和转录激活因子(STAT)途径与活化的PDGFR的相应磷酸化位点结合，使受体二聚化和自身磷酸化，并导致特定细胞内位点的酪氨酸残基磷酸化[24]，促进HSCs的有丝分裂和增殖，诱导肝纤维化的发展。
郑旭锐等[25]研究发现，姜黄素可以明显下调肝纤维化大鼠肝组织中PDGF-BB含量，抑制HSCs的活化与增殖，减少ECM的生成，发挥抗肝纤维化的作用。研究发现乌索酸、丹防胶囊可以通过阻断PDGF信号在HSCs细胞上的传递，降低ERK1/2的磷酸化水平，从而阻断PDGF/ERK信号通路，抑制HSCs细胞的增殖，干预肝纤维化的发生发展[26-27]。王金光等[28]表示大黄蛰虫丸能下调肝组织中PDGF-BB及PDGFR的表达，抑制HSCs细胞增殖活化，减少ECM沉积，抑制肝纤维化的发生。
1.1.3 VEGF与HSCs活化
VEGF是一种同源二聚体肝素结合糖蛋白，是最有效的促血管生成因子之一，可以在体内外促进血管生成。VEGF结合同源VEGF受体(VEGFR)可以诱导受体同二聚化或异二聚化，导致酪氨酸激酶的活化和受体细胞内结构域中酪氨酸残基的自磷酸化。磷酸酪氨酸和周围的氨基酸残基构成衔接分子的结合位点，启动各种细胞内信号传导途径，以诱导内皮细胞迁移和增殖，促进肝纤维化的发展[29-30]。VEGF还可与VEGFR-2结合，激活黏着斑激酶(FAK)相关的非激酶(FRNK)，导致肌成纤维细胞分化增加，成纤维细胞迁移增加，对成纤维细胞发挥促有丝分裂和促纤维化作用[31]。当肝脏处于相对缺氧状态时，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)活化并与下游靶基因上的HIF-1α结合位点结合，促进下游产物VEGF mRNA表达增加，促使病理性血管新生，肝脏的缺氧状态会导致病理性血管新生的恶性循环状态，加速肝纤维化进程。实验研究显示，膈下逐瘀汤和疏肝健脾活血方皆可以通过下调HIF-1α及VEGF mRNA的表达改善肝纤维大鼠肝损伤情况[32-33]。王宝家等[34]研究显示加减三甲散通过抑制肝组织VEGF mRNA及蛋白表达可以减少病理性微血管新生，从而促进肝纤维化的逆转与恢复，保护肝脏细胞的正常功能。
1.1.4 CTGF与HSCs活化
CTGF是富含于内皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞中的一种蛋白质，可以促进血管生成、骨骼生长和伤口愈合。早期研究显示，CTGF具有促成纤维细胞有丝分裂和趋化作用，可以诱导ECM沉积[35]。另有研究报道CTGF可增强成纤维细胞中α1(I)胶原，纤连蛋白和α5整合素的mRNA表达，促进肝纤维化的发展[36]。实际上，TGF-β可介导CTGF的活化，并在体外协调刺激结缔组织细胞增殖，以促进HSCs黏附、增殖和胶原产生，以及将HSCs诱导至肌成纤维细胞表型，诱导ECM的合成[37]。研究显示川芎嗪可能通过抑制TGF-β1及CTGF表达从而阻断Ⅰ型胶原的合成，发挥抗肝纤维化作用，这可能是其抗肝纤维化的一个重要分子机制[38]。贺文广等[39]表示雄芍汤可以通过降低TGF-β1及CTGF mRNA的表达，抑制HSCs的增生，减轻肝纤维化大鼠的肝细胞损伤，阻止或逆转肝纤维化进程。郑旭锐等[25]研究发现姜黄素可以下调肝纤维化模型大鼠肝组织中CTGF的表达，抑制HSCs的活化与增殖，减少ECM的生成，有望成为抗肝纤维化的有效药物。
1.2 诱导活化的HSCs凋亡
前期动物试验研究证明，诱导HSCs细胞凋亡可以促进纤维化的逆转，因此选择合适的药物诱导HSCs的凋亡以及确定调节HSCs凋亡途径具有相当的研究前景。通过死亡受体配体(TRAIL，FAS)和信号转导蛋白和转录因子[Rho/Rho激酶，Jun N末端激酶(JNK)，NF-κB]等途径可以有效诱导HSCs凋亡，阻断肝纤维化的进展[40]。目前我国中医药领域内利用B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白家族诱导HSCs细胞凋亡是相关研究中最多的一类，Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Bcl-2分别是Bcl-2家族中最有代表性的促进凋亡基因和抑制凋亡基因，Bax的二聚体可以打开线粒体膜上的通道，增加细胞膜通透性，加速细胞凋亡，Bcl-2可以与Bax形成异聚体，降低细胞膜通透性，阻止凋亡激活细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡。另外Bcl-2具有阻滞细胞周期作用，可以通过下调细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡，而Bax却可加速S期的进程，促进增殖。
近几年的研究显示川芎嗪可以通过激活p53蛋白上调p21和p27蛋白表达，导致肝星状细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制HSCs的细胞增殖；另外川芎嗪可显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并增强促凋亡蛋白Bax的表达，促进胞色素C的释放，最终诱导凋亡蛋白酶caspases切割底物，促进HSCs凋亡[41]。20(S)-原人参二醇、藏药波棱瓜子总木脂素及鳖甲煎丸等中药类提取物或方药都可以抑制HSCs的细胞增殖，并降低Bcl-2/Bax值，诱导HSCs的凋亡[42-44]。
2 调控脂肪细胞因子
脂肪细胞因子由脂肪组织分泌，是肝纤维化过程中的另一个主要因素[45]。其中瘦素是循环脂肪形成激素，具有促进纤维发生的能力[46-47]。与之相反，脂联素作为一种反调节激素具有抗纤维化活性作用，研究证实脂联素的表达可以降低肝纤维化进展[48]。
2.1 脂联素
脂联素是血浆中最丰富的脂肪因子，脂联素的两种主要受体(AdipoR1和AdipoR2)可以在肝脏中表达，并与其受体结合产生的信号传导对肝脏起到保护作用[49]。AdipoR1主要在骨骼肌和活化的HSCs中表达，而AdipoR2主要在其他肝细胞中表达。研究表明，AdipoR1和AdipoR2信号传导之间存在功能差异，AdipoR1的激活与磷酸腺苷蛋白激酶(AMPK)的激活有关，而AdipoR2信号传导与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) γ的激活更相关[50]。
2.1.1 AMPK与肝纤维化
AMPK是一种调节细胞代谢的中枢信号分子，长期以来一直被认为是介导脂联素、瘦素、胰岛素等激素代谢作用的关键分子[51]。除了在代谢中的作用外，AMPK信号传导在许多天然产物诱导的抗纤维化作用中起关键作用[52-53]。脂联素激活AMPK导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达增加，包括p27和p21蛋白和Akt通路的抑制，在抑制HSCs增殖中起关键作用[54]。此外，AMPK信号的通过激活调节转录激活因子p300抑制TGF-β诱导的HSCs中胶原蛋白和肌成纤维细胞标记物以及α-SMA的表达[55]。
2.1.2 PPARγ与肝纤维化
PPARγ是核受体家族成员，可以通过调节各种靶基因的表达在细胞分化，增殖和代谢中发挥重要作用。研究显示肝纤维化期间PPARγ的表达水平降低[56]。PPARγ可能在肝纤维化的发展中起抑制作用，是肝纤维化的潜在治疗靶点[57]。PPARγ的激动剂诱导脂肪细胞中脂联素的表达，可抑制HSCs中胶原蛋白α1和α-SMA mRNA的表达[58]，表明PPARγ在脂联素的转录激活以及抑制HSCs活化过程中起关键作用。
陈文龙等[59]研究表明益气化瘀化痰养阴方可以上调肝纤维化大鼠PPARγ的表达，维持HSCs静止表型，减轻表皮生长因子的致纤维化作用。魏丹芸等[60]发现五味子提取物联苯双酯可以上调HSCs细胞中的PPARγ表达，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。张扬武等[61]研究发现枇杷叶熊果酸可以上调大鼠肝星状细胞PPARγ表达，下调TGF-β表达而抑制HSCs细胞的活化，实现逆转肝纤维化的可能。近期研究显示，荔枝核总黄酮可明显上调PPARγ表达，抑制TGF-β，CTGF等生长因子的表达，减少ECM产生，以抑制HSCs细胞的增殖，有助于肝纤维化的逆转[62-63]。
2.1.3 基质金属蛋白酶抑制剂与肝纤维化
基质金属蛋白酶(MMP)是降解ECM过程中最主要的主要的胶原酶类，其中MMP-1是主要的间质胶原酶。基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)则可以降低MMP的活性并参与纤维化的进展，TIMP-1在抑制胶原蛋白降解中起着重要作用[64]。因此下调TIMP-1活化，促进MMP活化，是脂联素抗纤维化作用的潜在机制[65]。李绍民等[66]研究发现逍遥散含药血清可以提高MMP-1活力，降低TIMP-1活化，促进ECM降解，抑制HSCs细胞活化增值，具有很好的抗肝纤维化作用。王乾宇等[67]研究表明杜仲多糖可以上调肝纤维化大鼠MMP-1/TIMP-1值，促进Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白降解，进而减少ECM的沉积，逆转肝纤维化。陈冠新等[68]研究表明鳖甲煎丸能够显著减轻四氯化碳致大鼠肝纤维化的程度，减缓其发展，主要与鳖甲煎丸能够阻断NF-κB信号通路，减少其下游靶基因TIMP-1，TGF-β1的合成，上调MMP-2，MMP-9的表达，从而加快细胞外基质的降解有关。张志毕等[69]发现当归、川芎等药材的水溶性提取物阿魏酸钠可以通过调控MMP-1/TIMP-1信号通路，抑制乙醛诱导的体外HSC-T6细胞的增殖，活化和胶原分泌，控制肝纤维化的发展。
2.2 瘦素
瘦素在肝脏中由活化的HSCs分泌，分泌的瘦素又可以促进HSCs的增殖、迁移，形成正反馈环。另外瘦素可以通过Kupffer细胞分泌，Kupffer细胞是肝窦中的非实质细胞，可触发HSCs信号传导[70]。瘦素与PDGF一样，是HSCs的有效促分裂原，在体内和体外研究中，瘦蛋白促进HSCs进入细胞周期的M期，促进HSCs增殖。瘦素也是α1和α2原纤维转录激活的强大刺激物，α1和α2原纤维是致密的纤维化ECM的主要成分，可以刺激TIMP-1的转录激活，抑制MMP的合成[65]。体外实验表明，肿瘤坏死因子α凋亡诱导配体(TRAIL)可以选择性地靶向诱导HSCs进行细胞凋亡，但瘦素可使活化的HSCs不受TRIAL介导的细胞凋亡影响，促进肝纤维化。孟霞等[71]研究发现槲寄生碱可以下调肝纤维化大鼠中瘦素的表达，抑制JAK2/STAT3蛋白磷酸化，抑制HSCs增殖，拮抗肝纤维化。
3 抑制肝脏炎症反应
肝脏中慢性炎症持续的损伤肝细胞刺激肝纤维化的发展，包括白细胞的浸润和巨噬细胞的活化。虽然炎症反应的激活对于正常伤口愈合对损伤的反应是必不可少的，但是这种有益的激活的失调可以导致病理性纤维化反应的发生。肝脏中的慢性炎症诱导肝细胞的坏死和凋亡，当HSCs吞噬凋亡的肝细胞时，坏死的肝细胞刺激Kupffer细胞分泌炎症介质，并直接启动HSCs的激活程序[72]，相反HSCs的激活可以促进自然杀伤(NK)细胞，T细胞，巨噬细胞，树突细胞和内皮细胞等细胞的表达[70]。炎症和纤维化细胞之间存在正反馈环，这反过来加速纤维化的进展。因此，在确定的纤维化中，有效的抑制炎症活动，是改善纤维化状态甚至逆转纤维化过程的机制之一。
成嘉祁等[73]研究表明，青蒿总黄酮可以抑制肝纤维化小鼠肝脏及外周血中促炎因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表达，促进抗炎因子IL-10的表达，降低炎症反应，拮抗肝纤维化。周至品等[74]发现三叶香茶菜可以抑制NF-κB活化，使下游IL-6等其他炎症效应分子基因表达受到抑制，减轻肝组织炎症损伤和HSCs的活化，达到抗肝纤维化的作用。陈永欣等[75]研究发现满天星异荭草苷通过抑制NF-κB p65的表达，减轻炎症反应，可以抑制胶原合成、减少过多ECM沉积。研究表明，柴胡-黄芩药对、荔枝核总黄酮等药物可以通过调控TLR4/NF-κB信号通路抑制下游炎症因子的表达，减轻ECM的沉积，阻断肝纤维化进程[76-77]。
4 抗氧化应激
临床和实验数据表明，氧化应激通过产生活性氧(ROS)介导纤维化的进展。脂质，蛋白质和DNA的氧化破坏诱导肝细胞的坏死和凋亡，并且放大炎症反应，导致纤维化的开始。ROS刺激来自Kupffer细胞分泌以及炎性细胞的促纤维化介质的产生，诱导HSCs发生纤维化和增殖[78]。ROS信号可能受各种抗氧化酶活性的影响，其表达受到核因子NF-κB，核因子受体-1(NRF-1)等氧化还原反应敏感的转录因子调节。与活化的HSCs相比，静息的HSCs缺乏NF-κB，这表明NF-κB的氧化还原敏感性可以激活NF-κB靶向基因的表达，为静息HSCs的激活提供合适的细胞氧化还原阈值，促进其进入增殖周期。NRF-1的抑制可能改变抗氧化酶的表达，这些抗氧化酶可能扰乱细胞氧化还原环境，影响HSCs的增殖和肝细胞死亡，并促进胶原合成，导致肝纤维化[79]。
杨婧等[80-81]研究发现膈下逐瘀汤可以改善大鼠纤维化肝脏组织谷胱甘肽抗氧化系统，有效抑制ROS的产生，对肝脏组织氧化应激具有明显的抑制作用，可以逆转或阻止肝纤维化的发展。施京红等[82]研究显示莲子心可以提升机体超氧化物歧化酶的活性，抑制过氧化产物丙二醛的产生，具有很好清除氧自由基的能力，拮抗机体氧化应激反应，改善大鼠肝纤维化程度。陈巧云等[83]发现补骨脂酚可以提高细胞中抗氧化酶的活性，提高MMPs活性，降低胶原蛋白-Ⅰ含量，保护TGF-α诱导的人肝星状细胞损伤。以上研究表明抗氧化应激可能发展成治疗肝纤维化的靶点之一。
5 抑制肝窦内皮细胞毛细血管化
肝窦内皮细胞(LSECs)是一种高度特化的内皮细胞，具有这种特殊内皮细胞的形态和功能特征。LSECs是肝细胞和肝窦之间的网关，它们通过超滤系统或由窗孔组成的所谓“肝筛板”介导肝窦和肝细胞之间血浆、脂质和脂蛋白等物质的交换。LSECs可以维持HSCs静息状态，防止肝纤维化的进展。LSECs缺乏开窗并形成有组织的基底膜，即毛细血管化，可以诱导HSCs的活化，是纤维化的前奏[84]。维持有孔的LSECs表型需要由肝细胞或星状细胞分泌的VEGF刺激LSECs中内源性一氧化氮合酶(eNOS)的一氧化氮(NO)释放，NO反过来通过可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，三磷酸鸟苷(GTP)催化为环磷酸鸟苷(cGMP)，活化蛋白激酶G(PKG)，然后由PKG磷酸化蛋白质靶标，抑制LSECs毛细血管化[85]。另外有研究证明，Hedgehog信号在体外毛细血管化的LSECs中增加，表明抑制hedgehog信号的传导可以阻断LSECs毛细血管化[86]。
谢知兵等[87]研究发现扶正化瘀方可以逆转肝窦毛细血管化，恢复LSECs窗孔结构，阻断肝纤维化形成。鲁军等[88]研究表明疏肝健脾活血方可以逆转LSECs的失窗孔化，阻止肝窦毛细血管化的进一步加重，逆转纤维化进程。卢艳娴等[89]发现丹参多糖可以抑制肝损伤小鼠小窝蛋白的表达，开放肝窦内皮细胞窗孔，抑制肝窦细胞毛细血管化，减轻肝损伤。研究表明，姜黄素可以增加和扩大由瘦素引起的LSECs窗孔狭窄或消失，减弱细胞外基底膜的厚度和范围，降低肝窦毛细血管化，减轻肝纤维化程度[90]。
6 讨论与展望
综上所述，肝纤维化病因及机制复杂，多种细胞因子及细胞的炎症反应、氧化应激反应参与其中，构成复杂的调控网络。中药有效成分可通过抑制HSCs活化和诱导活化的HSCs凋亡、调控脂肪细胞因子、抑制肝脏炎症反应、抗氧化应激、抑制肝窦内皮细胞毛细血管化等方式达到抑制肝纤维化发展，在不同层面通过不同机制达到抗肝纤维化的目的，取得了较大的成就。相比于化学药物，中药的优点是多方面、多靶点和多层面，从整体上系统地调控各靶点抑制肝纤维化的进展。虽然目前对中药拮抗肝纤维化的机制研究已较为深入，但各个中药的研究机制仅局限于某一方面或某一信号通路，对于完整信号通路网络的研究较为浅显，无法系统、全面地体现其作用机制。肝纤维化的形成机制十分复杂，仅着眼于单一的信号通路或靶点抗肝纤维化恐难有成效，这亦是至今仍未有基于某一基因或蛋白质功能开发治疗肝纤维化的化学药物的原因之一。利用系统生物学研究方法对中药抗肝纤维化多方面、多信号传导体系的调控网络作进一步研究，将作用于HSCs活化的不同靶点的中药成分合理组成复方，这可能在肝纤维化治疗学上会有巨大的突破。
