恶性肿瘤严重危害人类健康，且肿瘤转移已成为肿瘤致死的主要原因，因此，预防和抑制肿瘤转移至关重要。肿瘤转移过程涉及上皮间质转化(EMT)及侵袭、进入循环系统、渗出脉管、形成转移灶、远端定植[1]。EMT是指上皮细胞上皮样特征减少，获得间充质细胞特性的过程。EMT是肿瘤发展和转移所需的重要生理环节，可作为抑制肿瘤转移的作用靶点[2-3]。EMT的发生与发展受控于肿瘤组织高表达的锌指转录因子Snail，碱性螺旋-环-螺旋转录因子Twist及E盒结合锌指蛋白(Zeb)等家族转录因子的作用[4-5]。某些中药有效成分如姜黄素、槲皮素、白藜芦醇、五味子乙素等具有调控EMT相关转录因子和信号通路的作用，对于抑制肿瘤转移具有一定的优势[6-9]；但这些成分存在溶解性较低、稳定性较差、缺乏组织特异性和生物安全性等问题，进而会影响药效发挥。利用纳米技术和纳米递送系统能够改善中药有效成分溶解性，提高其稳定性，实现高效靶向递送，从而增强药效、提高安全性、降低毒副作用[10-11]。本文从调控EMT角度出发，对相关的中药有效成分纳米递送系统及其研究进展进行综述，为结合该途径抑制肿瘤转移的研究提供参考。
1 EMT相关的转录因子和信号通路
EMT在胚胎发育、组织再生、肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要作用[2，12]。研究发现，在多种肿瘤组织中EMT相关转录因子异常表达，这些转录因子主要通过负调节E-钙黏蛋白表达诱导EMT[13-15]。E-钙黏蛋白在肿瘤细胞中表达下降或缺失不仅是EMT中肿瘤细胞上皮特征丧失的标准，也是促进肿瘤转移的重要表现，因此，E-钙黏蛋白降低成为了EMT过程的上皮细胞标志物。此外，作为间质标记物，N-钙黏蛋白、波形蛋白和纤连蛋白等表达增加[16]。EMT过程受多种转录因子和信号通路的调控。参与调控EMT的转录因子主要有Snail，Twist及Zeb家族等，信号通路涉及转化生长因子-β(TGF-β)，核转录因子-κB(NF-κB)，Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和Smad(drosophila mothers against decapentaplegic)，蛋白激酶B(Akt)，活化蛋白1(AP-1)，Wnt，Notch，Hedgehog，Hippo等[2，17-18]。EMT过程相关的转录因子和信号通路的作用机制研究为治疗肿瘤及抑制肿瘤转移提供了必要生物学基础。
对于EMT过程相关的转录因子，Snail家族成员Snail1和Slug(Snail2)等参与了与细胞分化和生存相关的各种过程，对于肿瘤发生起重要作用。Snail是可直接抑制E-钙黏蛋白转录的重要因子，可诱导EMT的发生[19-21]。Snail1及Slug能抑制E-钙黏蛋白表达，上调波形蛋白和纤连蛋白的表达[22]。Twist家族成员包括Twist1和Twist2，Twist1是EMT的重要调节者，可抑制E-钙黏蛋白的转录[23]，诱导N-钙黏蛋白和纤连蛋白的转录。Zeb家族成员包括Zeb1和Zeb2，是一组具有锌指结构的转录因子，其通过下调E-钙黏蛋白，上调波形蛋白、纤连蛋白、基质金属蛋白酶(MMPs)和N-钙黏蛋白的表达，导致上皮细胞之间的黏附性丧失，诱导EMT发生。Snail也可经诱导E-钙黏蛋白阻遏物如Zeb1和Zeb2的表达而降低E-钙黏蛋白的肿瘤转移抑制效应[5]。
目前，研究较为广泛的EMT主要信号通路如下：①TGF-β信号通路。TGF-β可以上调N-钙黏蛋白，波形蛋白，Slug以及Snail1的表达，下调E-钙黏蛋白和角蛋白表达，使细胞向肿瘤干细胞样表型转化[24-26]。体外乳腺癌上皮细胞在TGF-β1作用下表现为间质细胞样，证实TGF-β1可以诱导EMT的发生[27]。另外，通过抑制TGF-β的活性，可以阻断乳腺癌肺转移[28]。②Notch信号通路。该信号通路是调控细胞凋亡、迁移、侵袭和血管生成等多种过程的核心信号系统，能增加Snail的表达，并导致E-钙黏蛋白的缺失，诱导EMT的发生[17，29]。③Wnt/β-联蛋白信号通路。该信号通路能在EMT和肿瘤转移过程中发挥重要作用[30-32]。β-联蛋白与淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)/T细胞因子(T-cell factor，TCF)作为细胞核内基因的转录共激活因子，是Wnt信号通路的中心组成部分。当上皮钙黏素表达缺失时，β-联蛋白-TCF转录上调，从而促进EMT的发生[33-35]。此外，抑制NF-κB和Akt等信号通路的激活也可以抑制EMT的发生[36-37]。
2 调控EMT的中药有效成分纳米递送系统在抑制肿瘤转移中的应用
中药有效成分具有多作用靶点的特点，在抑制肿瘤转移方面具有一定的优势，其在调控EMT方面的作用也引起了越来越多的关注[2，8]。代表性中药有效成分主要有苯丙素类、二萜醌类、类异戊二烯类、生物碱类，具体成分有姜黄素、和厚朴酚、没食子酸、大黄素、槲皮素、五味子乙素、水飞蓟宾、表没食子儿茶素没食子酸酯、白藜芦醇、芍药苷、雷公藤甲素、苦参碱、马钱子碱、龙葵碱、汉防己甲素、桂皮醛、大蒜素、丹参酮ⅡA等[38-44]。上述有效成分均具有抑制肿瘤转移的作用。其中，姜黄素的相关研究最为广泛，抑制EMT作用机制涉及调控相关基因和蛋白表达，如E-钙黏蛋白，N-钙黏蛋白，β-联蛋白，Slug，Twist1，波形蛋白和纤连蛋白等，信号通路主要涉及Wnt，TGF-β，糖原合成酶激酶(GSK)-3β等，从而降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[45]。
然而，这些中药有效成分多存在水溶性较低、稳定性较差、体内被快速消除、药代动力学变异较大等问题，严重影响其体内药效发挥，安全性和有效性难以保障，从而限制了其临床应用[8]。纳米技术的出现很好的改善了这些问题，将药物包载于纳米载体中能够增加稳定性、改善水溶性、提高口服生物利用度，纳米载体可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)分布于肿瘤组织[46]。主动靶向纳米载体可更高效、安全和可靠地进行药物递送。此外，通过有机与无机杂化纳米载体利用联合疗法也有助于抑制肿瘤转移[47]。近几年，各种环境响应型纳米载体可实现刺激响应下释药[48]，相关研究也备受关注。
2.1 脂质体
脂质体作为一种有效的药物传递系统，一直是药物递送领域的研究热点之一。脂质体具有两亲结构及双分子层，生物相容性较好，易于制备，可包封亲水性和疏水性药物，易于表面修饰，也可以通过改变双分子层调节体内药代动力学行为，作为中药有效成分的载体研究较为广泛。
JU等[49]制备了载柔红霉素和双氢青蒿素(青蒿素的衍生物)的脂质体，其粒径较小、分散性较好。柔红霉素是一种非特异性化疗药物，临床应用时易产生副作用。双氢青蒿素对乳腺癌等多种肿瘤具有抗肿瘤作用，可抑制EMT。经奥曲肽(Oct)修饰共载柔红霉素和双氢青蒿素脂质体通过生长抑素受体(Oct-SSTRs)介导的主动靶向，利用双氢青蒿素阻断肿瘤细胞创伤愈合和迁移，增强细胞毒性和细胞摄取。Oct修饰的载柔红霉素和双氢青蒿素脂质体增强了E-钙黏蛋白活性，显著下调TGF-β1，血管内皮生长因子(VEGF)，整合素α5β1和MMP-2/9的表达，从而抑制转移。作用机制可能与抑制VEGF和其他血管生成因子、调控黏附信号转导以及TGF-β受体信号转导、降解细胞外基质有关[50-51]。
2.2 胶束
作为中药有效成分的递送载体，胶束可以控制药物释放，实现靶向作用，增强药效，降低毒副作用等。ZHAO等[52]制备了载雷公藤红素的四碘甲腺乙酸修饰的硬脂酸接枝壳聚糖胶束，通过阻断NF-κB信号通路，抑制乳腺癌生长和转移。与雷公藤红素以及类脂胶束相比，载药类脂胶束可显著降低4T1细胞NF-κB/MMP-9的表达，抑制肺转移细胞凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的活化，从而抑制乳腺癌生长和转移。
为改善齐墩果酸(oleanolic acid，OA)的溶解性和渗透性，WU等[53]将聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)和普朗尼克P105(pluronic P105)通过乙醇薄膜水合法制备了负载OA的混合胶束(OA-micelle)。TPGS和普朗尼克P105被用作表面活性剂以改善药物的溶解性和渗透性，降低OA的外排。TPGS是一种具有两亲水溶性分子结构的外排抑制剂。普朗尼克P105作为三嵌段共聚物，具有对多药耐药肿瘤增敏和包封疏水药物的能力。与游离OA组相比，胶束组促进了A549非小细胞肺癌(NSCLC)细胞对OA的摄取，凋亡率显著增高。OA-micelle可抑制NSCLC上皮间质转化。OA-micelle组E-钙黏蛋白表达增加，而N-钙黏蛋白降低，表明OA-micelle可调控EMT的发生，抑制肿瘤细胞的迁移。
两亲嵌段共聚物制备的pH敏感胶束可根据病变部位与机体正常状态pH差别实现刺激响应型释药。ZOU等[54]合成了pH敏感两亲性嵌段聚合物聚(2-乙基-2-噁唑啉)-聚乳酸(PEOz-PLA)，并将该聚合物与药物阿霉素(DOX)偶联形成轭合物(PEOz-PLA-imi-DOX)。该轭合物可自主装形成胶束，胶束内部包载亲脂性、难溶性中药有效成分和厚朴酚，形成共载药胶束。该胶束可以在肿瘤细胞胞内酸性环境中产生pH触发药物释放，降低在系统循环中由于提前释药而产生的毒副作用。表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的MDA-MB-231-luc-GFP荷瘤裸鼠体内实验结果表明，经静脉注射给药，与单载DOX胶束和单载和厚朴酚胶束组相比，共载药胶束具有理想的抗乳腺癌肺转移效果。该作用可能与以下因素有关：DOX可抑制DNA复制，和厚朴酚上调肿瘤转移抑制基因KISS1同时下调NF-κB，从而调控下游与转移作用相关的蛋白，如MMPs，EMT-相关蛋白和VEGF等。
2.3 聚合物纳米粒
聚合物纳米粒具有合成方法多样化、易于修饰、粒径较小且分布均匀等优势。聚合物纳米粒作为药物递送系统研究也较为广泛，在药物递送中发挥着重要作用。山竺提取物α-倒捻子素(α-mangostin，Mang)具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤和消炎的作用，也可调控EMT。Verma等[55]为了克服其水溶性和稳定性较差的不足，制备了载α-倒捻子素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米粒(Mang-NPs)，以提高其生物利用度和在靶器官的蓄积。Mang-NPs对胰腺肿瘤干细胞EMT的抑制作用与诱导E-钙黏蛋白的表达和抑制Slug的表达有关。
2.4 固体脂质纳米粒
固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLNs)具有生物相容性较好、易于制备、可控制药物释放、可实现工业化生产等优点[56]。水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟果实中提取的有效成分。其水溶性较差、生物利用度较低等因素限制了该药物药效的发挥。XU等[57]为了提高水飞蓟宾抑制乳腺癌转移的效果，制备了载水飞蓟宾含TPGS和磷脂酰胆碱的固体脂质纳米粒。该纳米粒在血清中具有较高的稳定性，可增强MDA-MB-231乳腺癌细胞对纳米粒的摄取。为阐明水飞蓟宾、空白脂质纳米粒和载药纳米粒对MDA-MB-231细胞抑制侵袭和迁移机制，通过免疫印迹法检测与EMT相关的Snail，MMP-2和MMP-9表达水平。SLNs可以高效、大量地在肿瘤组织内累积，与游离水飞蓟宾相比，载药纳米粒通过下调MMP-9和Snail的表达，对MDA-MB-231细胞的侵袭和迁移具有更强的抑制作用。首次发现空白脂质纳米粒也具有一定的抑制转移能力。载药纳米粒在小鼠模型中未表现出明显的全身毒性，安全性较好。
2.5 无机纳米载体
无机纳米载体作为中药有效成分纳米递送载体近些年发展迅猛。这类载体通常具有独特的组成和结构特征，其优势在于性质和结构较为稳定、尺寸均一可控等。此外，无机纳米载体在光学、电学、磁学和声学等方面具有特殊的理化性能，利用这些性能联合化疗可增强疾病治疗效果。有研究表明无机纳米载体自身也可发挥一定的抑制肿瘤转移的作用[58-59]。无机纳米载体由于其表面具有丰富的化学基团，故也可以进行表面修饰，制备功能化纳米载体。目前，用于递送调控EMT的中药有效成分抑制肿瘤转移的无机纳米粒有纳米金、纳米银和纳米硒等。
2.5.1 金纳米粒
金纳米粒易与药物通过共价偶联或非共价方式结合，可实现药物靶向递送[60]。Balakrishnan等[61]为了解决槲皮素(quercetin，Qu)水溶性较差的问题，制备了槲皮素偶联的金纳米粒(AuNPs-Qu-5)，利用AuNPs较小的粒径和较高的组织渗透性增强药物胞内递送，提高槲皮素的疗效。AuNPs-Qu-5作用于MCF-7和MDA-MB-231细胞，抑制了Snail，Slug和Twist的表达，从而上调上皮细胞E-钙黏蛋白的表达，下调N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)/VEGF受体-2(VEGFR-2)信号通路，AuNPs-Qu-5显著减少了磷酸化EGFR(p-EGFR)，VEGFR- 2，p-PI3K，Akt和p-GSK3β的蛋白表达，抑制了乳腺癌细胞的EMT，血管生成和转移。与游离槲皮素相比，AuNPs-Qu-5显著抑制了MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移和侵袭，表明AuNPs-Qu-5在抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭方面较游离槲皮素更有效。
2.5.2 银纳米粒
银纳米粒与金纳米粒相似，具有可进行表面修饰的基团，有助于增强药物递送效果。没食子酸作为一种强抗氧化剂存在于植物和许多水果中，对胶质瘤细胞、胃癌细胞和前列腺癌细胞的转移具有抑制作用。Sunil-Gowda等[62]以没食子酸(gallic acid，GA)为还原剂和稳定剂制备了没食子酸银纳米粒(GA-AgNPs)，考察其在辐射诱导条件下对A549细胞EMT标记物的影响。结果表明辐射条件下间充质标记物N-钙黏蛋白表达增加，而GA-AgNPs组降低了N-钙黏蛋白表达；在辐射条件下，启动EMT诱导基因的重要激活因子Snail表达同样增加，而GA-AgNPs组的Snail表达明显下降；GA-AgNPs还可以下调波形蛋白表达。
2.5.3 硒纳米粒
除了上述金属纳米粒，硒纳米粒作为一种非金属无机纳米粒也有相关研究报道。硒是一种基本微量元素，是硒蛋白的重要组成部分。硒化合物可以抑制肿瘤的发生，硒作为膳食补充剂可以降低肿瘤风险[63-65]。载药硒纳米粒能够增强药物抗肿瘤活性[66]。姜黄素(curcumin，Cur)是从姜黄中分离得到的一种天然多酚类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤等药理作用，但其溶解性较差、生物利用度较低。Kumari等[67]为结合姜黄素和硒的作用特点设计了负载姜黄素的纳米硒(Se-CurNPs)，以提高Cur的抗肿瘤治疗效果。与其他肿瘤细胞系相比，Se-CurNPs对结肠癌细胞HCT116的细胞毒性最强。此外，Se-CurNPs下调了上皮-间质转化相关蛋白CD44(N-钙黏蛋白)，下调NF-κB信号通路标记物磷酸化NF-κB(phospho-NF-κB)，从而抑制了EMT，促进细胞自噬和凋亡。艾氏腹水癌(EAC)荷瘤小鼠体内实验结果表明，Se-CurNPs可显著抑制小鼠肿瘤生长，提高小鼠生存时间。
2.5.4 金属有机网络纳米复合物
儿茶酚类物质除了具有克服耐药性等药理作用之外，还可以与金属离子结合形成包被膜，附着于纳米粒表面。FAN等[68]将表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)与铁离子结合制备EGCG/铁离子纳米复合物(EIN)。与未包覆的纳米粒或胶束相比，EIN包覆的介孔二氧化硅纳米粒(MSN@EIN)和聚乙二醇(PEG)-PLA胶束(Mic@EIN)提高了细胞内药物浓度，也降低了药物对肝脏和肾脏的毒副作用。MSN@EIN和Mic@EIN能够抑制乳腺癌细胞4T1侵袭、迁移和降解细胞外基质，两者均可下调MMP-2/9和VEGF表达。体内动物实验结果揭示，MSN@EIN和Mic@EIN通过下调MMP-2/9表达来抑制细胞外基质降解，调控波形蛋白和E-钙黏蛋白表达，阻滞EMT过程，从而抑制肿瘤转移。
3 展望
EMT是一个复杂、多途径的发展过程，是肿瘤转移过程中的重要环节。近年来，针对抑制肿瘤转移、调控EMT的中药有效成分纳米递送系统的研究取得了一定进展。作为中药有效成分的载体，各种纳米载体在改善药物的溶解性与透过性、提高药物稳定性、实现控制药物释放和靶向递送药物方面具有一定的优势，可以更好地发挥药物对EMT的调控作用，从而增强抑制肿瘤转移的效果。因此，从调控EMT角度出发构建中药有效成分纳米递送系统已成为抑制肿瘤转移的策略之一。研究表明EMT对中枢和外周神经系统肿瘤和部分间质肿瘤如肉瘤的生物学行为具有显著影响，并且EMT赋予了肿瘤细胞相关特性，但基于EMT及肿瘤转移过程的复杂性，相关研究仍存在着很大的局限性。关于各种基于调控EMT的中药有效成分纳米递送系统的体内生物学行为，与生理环境之间的相互作用，调控EMT对整体抑制肿瘤转移的贡献度等研究尚不充分；更深入地研究和揭示其体内相关作用机制，为药物递送领域研究提供生物学基础，科学合理地设计高效纳米递送系统，增强药物抑制肿瘤转移的效果等相关研究还有待进一步完善。
Epithelial mesenchymal transition by c-Fos estrogen receptor activation involves nuclear translocation of beta-catenin and upregulation of beta-catenin/lymphoid enhancer binding factor-1 transcriptional activity
[J]．J Cell Biol，2000，148(1)：173-178.