随着物质水平的不断上升,人们越来越注重养生保健。冬虫夏草为麦角菌科植物真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体,与人参、鹿茸一起被称为“中药三大宝”[1]。冬虫夏草功效为补肾益肺、止血化痰,现代研究证实其次生代谢产物具有双向免疫调节[2]、抗肿瘤[3]、抗糖尿病肾病[4]、抗氧化防衰老[5]、抑制肝纤维化[6]等药理作用,且因其特异的性状结构和生理特性,人们对冬虫夏草的疗效赋予了较高的赞誉。因为生长条件严苛,所以数量本就稀少,进而导致价格非常昂贵,在经历了大量采挖之后,冬虫夏草野生品种日渐匮乏,在加强对其野生品种保护的同时,也逐渐有了对其类似功效替代品的研究。
金水宝胶囊是一种发酵虫草菌粉,源自于冬虫夏草中获得的一株蝙蝠蛾拟青霉菌株Cs-4发酵而成,具有增强免疫力、提高缺氧耐受力、缓解疲劳的保健功能[7],经检测,其所含化学成分和药理作用与冬虫夏草相似,可作为替代品使用[8]。发酵虫草菌粉的出现,缓解了野生冬虫夏草资源短缺的问题,随着其发酵工艺日渐成熟,带有发酵虫草菌粉的制剂也较为普遍[9],且价格更能为广大民众所接受。
冬虫夏草菌种经基质选择、发酵培养、发酵后处理等阶段后得到发酵完全的虫草菌粉,在整个生产过程中质量的控制尤为重要。赵斌[10]应用X射线衍射Fourier指纹图谱所具有的专属性及特征标记峰进行识别,对中成药进行整体评价,为金水宝胶囊真伪的鉴定提供了简单可信的分析方法;ZHANG等[11]采用GC-MS对金水宝胶囊中挥发性成分进行了定性和定量研究,为菌丝体的质量评价提供了依据;朱卫丰等[12]运用HPLC建立了金水宝胶囊发酵虫草菌粉的多糖指纹图谱,并对组成发酵虫草菌粉多糖的11种单糖进行了鉴别,客观地评价了其质量。在前期研究基础上,本实验拟建立金水宝胶囊的指纹图谱,并对其不同生产阶段样品进行取样分析,以期为金水宝胶囊的化学成分鉴别及其生产过程的质量控制提供参考。
1 材料和方法
1.1 仪器和试药
1200 Infinity型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。生产过程中的母瓶、斜面、小发酵、中间体样品都是干燥的粉末,均来自江西济民可信集团有限公司,是在金水宝胶囊的生产过程中取样,样品信息见表1。腺苷、鸟苷、尿苷、麦角甾醇对照品(上海源叶生物科技有限公司,批号分别为Z23S7J21814,AJ0609NA14,TM0313XA13,J26M6K1,纯度均≥98%),水为娃哈哈纯净水,甲醇、磷酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
No. | 样品 | 批号 |
---|---|---|
1 | 斜面 | 2018-02-11 |
2 | 母瓶 | 2018-02-08 |
3 | 小发酵 | 2018-02-13 |
4 | 中间体 | 2018-02-27 |
5 | 发酵虫草菌粉 | 18020103 |
1.2 溶液的制备
1.2.1 供试品溶液
取样品粉末约0.4 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入25%甲醇10 mL,密塞,称定质量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz,下同)40 min,放冷,再称定质量,加25%甲醇补足减失的质量,置于15 mL离心管中,离心5 min(5 000 r·min-1,4 ℃),取上清液1 mL置于10 mL量瓶中,加25%甲醇定容,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,得供腺苷、鸟苷、尿苷含量测定的供试品溶液。取样品粉末0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇30 mL,称定质量,超声60 min,放冷,再称定质量,加甲醇补足减失的质量,摇匀,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,得供麦角甾醇含量测定的供试品溶液。
1.2.2 对照品溶液
取腺苷、鸟苷、尿苷对照品适量,精密称定,分别置于不同的25 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,各精密量取2 mL,分别置于不同的50 mL量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,制成每1 mL分别含腺苷、鸟苷、尿苷16,18,19 μg的溶液。取麦角甾醇对照品适量,精密称定,加甲醇定容,摇匀,制成每1 mL含麦角甾醇80 μg的溶液。
1.3 色谱条件
腺苷、鸟苷、尿苷含量测定的色谱条件为Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脱(0~14 min,100%~99%B;14~19 min,99%~89%B;19~39 min,89%~85%B),流速0.4 mL·min-1,柱温30 ℃,进样量10 μL,检测波长260 nm。麦角甾醇含量测定的色谱条件为Ultimate AQ-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相甲醇-水(98∶2),流速1 mL·min-1,柱温25 ℃,进样量10 μL,检测波长283 nm。
2 结果
2.1 指纹图谱的建立
金水宝胶囊生产过程中的斜面、母瓶、小发酵、中间体以及发酵虫草菌粉样品的指纹图谱见图1。结果发现发酵虫草菌粉在生产过程中的不同阶段特征性化合物差别不大。基于特征图谱能定位出生产过程中稳定的化合物以及阶段性化合物。
2.2 基于HPLC定量分析腺苷类成分的方法学考察
2.2.1 线性关系考察
精密吸取1.2.2项下腺苷、鸟苷、尿苷对照品溶液2,4,6,8,10 mL,分别置于10 mL量瓶中,加25%甲醇至刻度,摇匀,按1.3项下色谱条件测定,以进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程,见表2。结果发现腺苷、鸟苷、尿苷在各自质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。
化合物 | 线性方程 | R2 | 线性范围/μg |
---|---|---|---|
尿苷 | Y=243.83X-0.89 | 1.000 0 | 0.038~0.19 |
腺苷 | Y=280.30X+0.86 | 1.000 0 | 0.032~0.16 |
鸟苷 | Y=186.69X-2.45 | 0.999 8 | 0.036~0.18 |
2.2.2 精密度试验
取发酵虫草菌粉样品,按1.2.1项下方法制备供试品溶液,按1.3项下色谱条件连续进样6次,计算腺苷、鸟苷、尿苷峰面积的RSD均<1.0%,表明仪器精密度良好。
2.2.3 重复性试验
平行制备6份发酵虫草菌粉供试品溶液,按1.3项色谱条件测定,计算腺苷、鸟苷、尿苷平均质量分数分别为2.57,3.30,2.64 mg·g-1,RSD均<1.0%,表明该方法重复性良好。
2.2.4 稳定性试验
取发酵虫草菌粉供试品溶液,分别于制备后0,12,24,36,48,60 h按1.3项下色谱条件测定,计算腺苷、鸟苷、尿苷峰面积的RSD分别为1.3%,1.6%,2.5%,表明供试品溶液在60 h内稳定。
2.2.5 回收率试验
取已知指标成分含量的发酵虫草菌粉样品适量,分别按样品中指标成分含量添加等量腺苷、鸟苷、尿苷对照品,按1.2.1项下方法制备供试品溶液,按1.3项下色谱条件测定,计算腺苷、鸟苷、尿苷平均加样回收率分别为106.06%,101.25%,105.88%,RSD分别为1.8%,2.8%,2.4%,表明该方法准确可靠。
2.3 样品测定
生产过程中斜面、母瓶、小发酵、中间体样品中指标成分的含量见表3。结果发现斜面样品中尿苷、腺苷、鸟苷的质量分数分别分别为0.97~3.15,0.64~2.12,2.06~3.79 mg·g-1;母瓶样品中尿苷、腺苷、鸟苷的质量分数分别为3.36~4.09,2.06~3.06,2.76~4.18 mg·g-1;小发酵样品中尿苷、腺苷、鸟苷的质量分数分别为2.61~3.30,2.12~2.45,2.67~2.82 mg·g-1;中间体样品中尿苷、腺苷、鸟苷的质量分数分别为1.91~4.93,2.36~2.70,3.36~4.48 mg·g-1。
样品 | 取样量/g | 尿苷质量分数/mg·g-1 | 腺苷质量分数/mg·g-1 | 鸟苷质量分数/mg·g-1 |
---|---|---|---|---|
斜面 | 2.08 | 2.73 | 2.12 | 3.36 |
斜面 | 2.25 | 1.21 | 0.64 | 2.30 |
斜面 | 3.08 | 0.97 | 1.00 | 2.06 |
斜面 | 3.26 | 2.27 | 0.76 | 3.39 |
斜面 | 4.10 | 1.12 | 0.76 | 2.54 |
斜面 | 4.21 | 3.15 | 1.70 | 3.79 |
母瓶 | 2.11 | 4.09 | 2.91 | 4.03 |
母瓶 | 3.02 | 3.91 | 2.06 | 2.76 |
母瓶 | 3.17 | 3.36 | 2.70 | 4.00 |
母瓶 | 4.03 | 4.09 | 3.06 | 4.18 |
小发酵 | 2.13 | 2.61 | 2.12 | 2.67 |
小发酵 | 3.05 | 3.30 | 2.45 | 2.82 |
中间体 | 2.27 | 4.76 | 2.36 | 4.21 |
中间体 | 3.07 | 4.93 | 2.70 | 4.48 |
中间体 | 3.08 | 1.91 | 2.42 | 3.36 |
2.4 不同批次样品的含量测定
对金水宝胶囊进行抽样测定,分别在2016—2018年各抽取20批次的样品,按1.2.1项下方法制备供试品溶液,按1.3项下色谱条件测定样品中腺苷、鸟苷、尿苷以及麦角甾醇的含量,见表4,表5,表6。结果表明2016—2018年不同批次样品中腺苷和麦角甾醇的含量均符合2015年版《中国药典》的标准,其中鸟苷质量分数0.97~1.36 mg/粒,尿苷质量分数0.67~1.38 mg/粒。
样品批号 | 尿苷 | 腺苷 | 鸟苷 | 麦角甾醇 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | |
160148 | 16.54 | 0.67 | 22.87 | 0.86 | 26.62 | 1.07 | 7.74 | 0.88 |
160149 | 16.59 | 0.77 | 22.92 | 0.96 | 26.68 | 1.22 | 7.70 | 0.84 |
160150 | 16.53 | 1.22 | 22.77 | 1.02 | 26.64 | 1.29 | 7.70 | 0.91 |
160306 | 16.94 | 0.84 | 23.41 | 0.88 | 26.80 | 1.14 | 7.77 | 0.92 |
160307 | 16.90 | 0.84 | 23.35 | 0.85 | 26.77 | 1.15 | 7.77 | 0.94 |
160309 | 17.41 | 1.05 | 23.84 | 1.03 | 26.97 | 1.24 | 7.78 | 0.92 |
160428 | 17.16 | 1.11 | 23.61 | 0.93 | 26.88 | 1.22 | 7.76 | 0.99 |
160429 | 17.48 | 0.94 | 23.87 | 0.94 | 27.06 | 1.13 | 7.76 | 0.95 |
160632 | 17.13 | 0.87 | 23.54 | 0.94 | 26.87 | 1.09 | 7.88 | 0.96 |
160633 | 17.15 | 0.87 | 23.54 | 0.99 | 26.88 | 1.20 | 7.86 | 0.97 |
160736 | 17.18 | 0.90 | 23.56 | 0.98 | 26.89 | 1.15 | 7.86 | 1.07 |
160739 | 17.07 | 1.10 | 23.47 | 1.08 | 26.83 | 1.25 | 7.86 | 0.93 |
160854 | 17.12 | 0.91 | 23.50 | 0.98 | 26.87 | 1.10 | 7.89 | 1.03 |
160858 | 17.27 | 0.91 | 23.54 | 0.97 | 26.94 | 1.11 | 7.25 | 1.01 |
160911 | 17.37 | 1.02 | 23.99 | 0.93 | 27.02 | 1.15 | 7.83 | 1.00 |
161015 | 17.17 | 1.32 | 23.53 | 0.99 | 26.87 | 1.36 | 7.95 | 1.05 |
161140 | 17.17 | 0.92 | 23.45 | 0.96 | 26.88 | 1.25 | 7.86 | 1.02 |
161274 | 17.14 | 1.00 | 23.54 | 0.92 | 26.89 | 1.05 | 7.84 | 1.06 |
161275 | 17.19 | 1.22 | 23.58 | 1.00 | 26.91 | 1.22 | 7.84 | 1.02 |
161277 | 17.02 | 1.27 | 23.41 | 1.09 | 26.67 | 1.30 | 7.84 | 1.02 |
样品批号 | 尿苷 | 腺苷 | 鸟苷 | 麦角甾醇 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | |
170125 | 17.44 | 1.15 | 24.50 | 1.06 | 27.13 | 1.22 | 7.75 | 1.08 |
170127 | 17.33 | 1.12 | 24.19 | 0.95 | 27.06 | 1.20 | 7.75 | 1.05 |
170129 | 17.25 | 1.14 | 24.06 | 1.00 | 27.01 | 1.28 | 7.76 | 0.97 |
170211 | 17.21 | 1.24 | 24.01 | 1.02 | 26.99 | 1.29 | 7.75 | 1.04 |
170212 | 17.18 | 1.18 | 23.96 | 1.00 | 26.97 | 1.28 | 7.74 | 1.14 |
170215 | 17.25 | 1.20 | 23.97 | 1.01 | 27.01 | 1.25 | 7.73 | 1.08 |
170320 | 17.07 | 1.21 | 23.78 | 1.06 | 26.92 | 1.23 | 7.72 | 1.10 |
170322 | 17.03 | 1.18 | 23.74 | 0.96 | 26.90 | 1.12 | 7.73 | 1.06 |
170323 | 17.04 | 1.11 | 23.75 | 0.96 | 26.91 | 1.13 | 7.73 | 1.08 |
170412 | 17.11 | 1.37 | 23.78 | 1.03 | 26.94 | 1.23 | 7.74 | 1.10 |
170414 | 16.98 | 1.35 | 23.67 | 1.00 | 26.88 | 1.18 | 7.74 | 1.06 |
170416 | 16.96 | 1.08 | 23.62 | 0.97 | 26.87 | 1.14 | 7.75 | 1.09 |
170502 | 16.97 | 1.11 | 23.62 | 0.99 | 26.87 | 1.12 | 7.79 | 1.08 |
170504 | 16.92 | 0.98 | 23.57 | 0.93 | 26.84 | 1.01 | 7.79 | 1.04 |
170729 | 16.91 | 1.24 | 23.57 | 1.02 | 26.83 | 1.24 | 7.78 | 1.08 |
170807 | 16.92 | 1.38 | 23.56 | 1.11 | 26.85 | 1.33 | 7.76 | 1.14 |
170928 | 16.96 | 1.27 | 23.60 | 0.99 | 26.87 | 1.25 | 7.86 | 1.15 |
171031 | 19.20 | 1.20 | 23.63 | 0.81 | 26.89 | 1.10 | 7.85 | 1.16 |
171161 | 16.98 | 1.17 | 23.61 | 0.84 | 26.92 | 0.97 | 7.85 | 1.17 |
171242 | 17.03 | 1.14 | 23.65 | 1.06 | 26.93 | 1.07 | 7.86 | 1.23 |
样品批号 | 尿苷 | 腺苷 | 鸟苷 | 麦角甾醇 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | tR/min | 质量/mg | |
180109 | 17.20 | 1.16 | 23.76 | 1.01 | 26.99 | 1.09 | 7.85 | 1.22 |
180203 | 17.17 | 1.16 | 23.70 | 1.01 | 26.96 | 1.09 | 7.85 | 1.22 |
180204 | 17.14 | 1.30 | 23.68 | 0.91 | 26.94 | 1.20 | 7.87 | 1.27 |
180205 | 17.19 | 1.33 | 23.72 | 0.98 | 26.97 | 1.16 | 7.86 | 1.22 |
180221 | 17.30 | 1.23 | 23.78 | 1.02 | 27.00 | 1.15 | 7.85 | 1.23 |
180222 | 17.16 | 1.29 | 23.67 | 1.08 | 26.95 | 1.19 | 7.80 | 1.20 |
180402 | 17.06 | 1.32 | 23.60 | 1.01 | 26.91 | 1.21 | 7.81 | 1.19 |
180405 | 17.28 | 1.27 | 24.02 | 0.98 | 27.04 | 1.22 | 7.82 | 1.20 |
180409 | 17.32 | 1.30 | 24.02 | 1.05 | 27.07 | 1.28 | 7.82 | 1.26 |
180411 | 17.28 | 1.32 | 23.96 | 1.09 | 27.03 | 1.26 | 7.83 | 1.29 |
180417 | 17.31 | 1.23 | 23.96 | 1.04 | 27.04 | 1.17 | 7.83 | 1.25 |
170502 | 17.35 | 1.26 | 24.00 | 1.03 | 27.09 | 1.20 | 7.89 | 1.22 |
180503 | 17.37 | 1.24 | 23.91 | 1.12 | 27.08 | 1.22 | 7.88 | 1.27 |
180504 | 17.29 | 1.20 | 23.90 | 1.03 | 27.22 | 1.15 | 7.88 | 1.29 |
180506 | 17.25 | 1.09 | 23.86 | 1.06 | 27.02 | 1.09 | 7.88 | 1.18 |
180509 | 17.28 | 1.23 | 23.89 | 0.96 | 27.04 | 1.20 | 7.88 | 1.25 |
180609 | 17.34 | 1.20 | 23.93 | 0.96 | 27.05 | 1.11 | 7.88 | 1.21 |
180619 | 17.23 | 1.03 | 23.85 | 0.85 | 27.01 | 1.02 | 7.89 | 1.29 |
180624 | 17.25 | 1.00 | 23.85 | 0.97 | 27.21 | 1.07 | 7.90 | 1.23 |
180703 | 17.32 | 1.34 | 23.91 | 1.11 | 27.05 | 1.34 | 7.89 | 1.21 |
3 讨论
目前,市面上所售的人工发酵虫草菌丝粉种类繁多,主要有发酵虫草菌粉、发酵冬虫夏草菌粉、虫草头孢菌粉、虫草被孢菌粉、人工虫草菌丝粉五大类[9],通过菌种保存-斜面菌种-摇瓶种子-发酵罐一系列流程后,将菌种制成相应的剂型并应用于临床[13]。由于菌种来源不同,不同厂家生产过程也不同,这对有效成分种类和含量的影响较大,进而导致功能主治存在一定差异。但就现在市面所售的发酵虫草菌粉类药品来说,不同厂家对于药品功能主治的描述区别不明显,亟需加强各类发酵虫草菌粉成药的药理活性区分研究。药物的药理活性主要通过其在体内的有效代谢产物发挥作用,对于这些基础代谢物质应当有较为清晰的认识。国内对于发酵虫草菌粉基础物质研究较多,也比较全面,但关于这些基础物质在生产过程中的稳定性与均一性研究还比较欠缺。
本文对金水宝胶囊前期各生产阶段样品的指纹图谱进行了采集,采用甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱的方法对核苷类成分进行分离,获得了较好的效果,并确定发酵虫草菌粉不同生产阶段样品的指纹图谱主要为核苷类成分,对其中含量较高的3种核苷类成分(腺苷、鸟苷、尿苷)进行方法学考察,结果发现在该方法下三者线性关系、回收率、稳定性均很好,且专属性强,适合作为发酵虫草菌粉类药品的质量控制指标。通过对2016—2018年金水宝胶囊样品进行抽查后显示,腺苷、麦角甾醇含量较为稳定,均符合2015年版《中国药典》的标准。综合分析,成药的样品抽查检测过程中各个指标成分含量较高,也比较稳定。
核苷类成分是发酵虫草菌粉发挥主要药理作用的物质,腺苷、鸟苷、尿苷更是其中的优势代谢产物,这3种成分具有广泛的药理活性[14]。本研究设定了2种提取方法和色谱条件,分别用于测定腺苷、鸟苷、尿苷以及麦角甾醇的含量,可为金水宝胶囊的整体质量控制提供参考。后续还将对发酵虫草菌粉的发酵条件进行优化,结合HPLC含量测定筛选出有效成分含量最高的生产条件,比如发酵的基底、时间、温度以及pH等,以便更好地控制发酵虫草菌粉的生产过程。另外,还可结合冬虫夏草菌丝的指纹图谱,随时记录菌丝体的特征和生产速率[15-16],建立标准化的菌种保藏、培养、传代体系,保持菌种的活力[17]。
Antidiabetic and antinephritic activities of aqueous extract of Cordyceps militaris fruit body in diet-streptozotocin-induced diabetic sprague dawley rats
[J].Oxid Med Cell Longev,2016,doi:10.1155/2016/9685257.