枳壳为芸香科植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实[1]，性微寒，味苦、辛、酸，其主要成分包括生物碱类、挥发油和黄酮类[2]，此外还有三萜内酯类、香豆素类和无机盐等[3]，具有抗菌、抗炎、抗休克、降血脂及调节胃肠运动等广泛药理作用[4-9]，临床上常用于治疗胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、脏器下垂[10]。
枳壳作为常用理气药，入药以麸炒品为主[1]，相应的研究也较多[11-14]。而广东省习用的炮制品种是制枳壳，其由生枳壳通过浸泡、发酵、蒸煮、闷润，直到枳壳内部变紫褐色，取出干燥所得[15]。制枳壳气味芳香、醇厚，药性较生品趋于缓和，具有良好的和胃作用，但目前国内外关于制枳壳的文献研究较少。在枳壳发挥理气、行滞、祛痰、平喘等药效的成分中，黄酮类成分占据了很大比例[16]，主要包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和芸香柚皮苷等[17]，但对于这4种成分炮制前后的含量变化研究较少。目前已有学者建立了生枳壳和麸炒枳壳的HPLC指纹图谱分析方法[14，18-19]，但制枳壳的指纹图谱研究尚未见报道，生枳壳、麸炒枳壳与制枳壳3种炮制品的指纹图谱及指标成分含量有何差异也未见报道。基于此，本实验采用HPLC对枳壳生品及其炮制品进行研究，建立枳壳生品及其炮制品的指纹图谱，并对4个黄酮类成分进行含量测定，旨在证明枳壳炮制前后化学成分发生了质变与量变，为枳壳及其炮制品的质量评价及临床精准使用提供依据。
1 材料
2690型高效液相色谱系统(美国Waters公司，包括2998型二极管阵列检测器，Empower工作站)，SQP型1/10万电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，ME104/02型1/1万电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，FW135型粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
新橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷和橙皮苷对照品(中国科学院成都生物研究所，批号分别为MUST-16041912，MUST-16081309，MUST-16030408，MUST-15070211，纯度分别为98.08%，98.28%，99.20%，99.70%)，水为超纯水，乙腈、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
生枳壳、麸炒枳壳和制枳壳各15批，产地均为江西，来源于广州健泽药业有限公司，经广东药科大学中药学院中药资源学科刘基柱教授鉴定，均为芸香科植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果实，麸炒枳壳的炮制规格符合2015年版《中国药典》的炮制要求[1]，制枳壳符合2011年版《广东省中药饮片炮制规范》(第一册)的炮制要求；3种炮制品的批号均分别为160601～160606，160701～160709，相对应的生枳壳编号为s1～s15，麸炒枳壳编号为f1～f15，制枳壳编号为z1～z15。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱(0～15 min，10%～27%A；15～20 min，27%～28%A；20～30 min，28%～30%A；30～35 min，30%～43%A)，检测波长283 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，进样量5 μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液
取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷4种对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为13.9，92.4，10.3，35.5 mg·L-1的混合对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液
精密称取样品粗粉约0.5 g，置250 mL圆底烧瓶中，精密加入水50 mL，加热回流1.5 h，放冷，摇匀，抽滤，减压浓缩(60 ℃)至5 mL，加水定容于25 mL量瓶中，摇匀，精密量取1 mL定容于10 mL量瓶中，即得，进样前过0.22 μm微孔滤膜。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
取同一供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果表明各色谱峰相对保留时间的RSD均<2.0%，相对峰面积的RSD均<3.0%，表明仪器具有良好的精密度。
2.3.2 重复性试验
取同一样品(编号s2)粗粉6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，结果各色谱峰相保留时间的RSD均<2.0%，相对峰面积的RSD均<3.0%，表明该方法的重复性良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在制备后0，4，8，12，16，20，24 h进样，按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。结果各色谱峰相对保留时间的RSD均<2.0%，相对峰面积的RSD均<3.0%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。
2.4 HPLC指纹图谱的建立与分析
2.4.1 HPLC指纹图谱的建立
取混合对照品溶液按照2.1项下色谱条件进样，获取混合对照品溶液的色谱图，见图1。将15批生枳壳、麸炒枳壳和制枳壳分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。将各样品的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)，采用中位数法和多点校正法，时间宽度0.10 min，生成相应的对照指纹图谱，共有模式及对照指纹图谱见图2，图3，图4，以柚皮苷为参照峰，生枳壳标定了8个共有峰，麸炒枳壳标定了15个共有峰，制枳壳标定了11个共有峰。同时计算得出各批次样品指纹图谱与各自生成的对照指纹图谱的相似度均>0.95，表明其各批次样品之间相似度高，炮制工艺稳定。
2.4.2 HPLC指纹图谱分析
将三者的共有模式进行对比研究，由叠加图发现，三者所含共有峰为6个(1～6号峰)，其中3，4，5和6号色谱峰分别为芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，见图5。与生枳壳相比，麸炒枳壳的色谱峰种类和数目均发生了变化，其中7～15号峰为新增峰，2号共有峰的峰高降低较明显，3号峰(芸香柚皮苷)和5号峰(橙皮苷)的峰高增加较明显；与生枳壳相比，制枳壳的色谱峰种类和数目均亦发生了变化，其中16～19号峰为新增峰，共有峰中的4号峰(柚皮苷)峰高呈较明显的降低趋势。说明枳壳经麸炒或者发酵、蒸煮后所含化学成分的种类和含量均发生了不同程度的变化。
2.4.3 系统聚类分析
选择15批生枳壳、麸炒枳壳和制枳壳为研究对象，以柚皮苷为参照峰，将6个共有峰的相对峰面积导入SPSS 20.0统计软件，使用平均联接(组间)的方法进行聚类分析，见图6。结果发现15批生枳壳、麸炒枳壳和制枳壳的聚类较好，均能各自聚为一类，表明这6种共有化学成分存在明显的组间差异。
2.5 黄酮类成分的含量测定
2.5.1 色谱条件
Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80)为流动相，检测波长为283 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL。以柚皮苷峰的理论板数计算不低于3 000。
2.5.2 溶液的制备
对照品溶液的制备方法同2.2.1项。精密称取样品粗粉约0.2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液，进样前用0.22 μm微孔滤膜过滤。
2.5.3 线性关系、检测限和定量限的考察
精密量取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的混合对照品溶液适量，加甲醇稀释，得系列质量浓度的混合对照品溶液(芸香柚皮苷质量浓度分别为2.76，5.52，6.89，13.79，27.58，68.94 mg·L-1；柚皮苷质量浓度分别为35.62，71.63，106.85，142.47，178.08 mg·L-1；橙皮苷质量浓度分别为2.05，4.11，5.13，10.27，20.54，51.35 mg·L-1；新橙皮苷质量浓度分别为42.96，85.92，128.88，171.84，214.80 mg·L-1)，按2.5.1项下色谱条件进样分析。以对照品质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷回归方程分别为Y＝5 901X＋2 631(r＝0.999 6)，Y＝14 431X-25 531(r＝0.999 5)，Y＝5 242.4X＋289.92(r＝0.999 7)，Y＝28 828X-13 260(r＝0.999 8)，线性范围分别为0.027 6～0.689 4，0.356 2～1.780 8，0.020 5～0.513 5，0.429 6～2.148 0 μg。计算芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的检测限(S/N＝3)分别为5.52，3.63，4.11，2.79 μg·L-1，定量限(S/N＝10)分别为13.79，9.08，10.27，13.93 μg·L-1。
2.5.4 加样回收率考察
精密称取编号为s2的生枳壳粗粉6份，每份约0.1 g，每份均加入适量芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷对照品，按照2.5.2项下方法制备样品溶液，按2.5.1项下色谱条件测定，计算平均加样回收率处于97.81%～102.82%，RSD均<2.0%，表明该方法准确可靠，具体数据见表1。
| 成分 | 称样量/g | 样品中量/mg | 加入量/mg | 测得量/mg | 回收率/% | 平均值/% | RSD/% |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 芸香柚皮苷 | 0.100 7 | 0.755 3 | 0.715 0 | 1.478 3 | 101.12 | 100.86 | 0.4 |
| 0.100 6 | 0.754 5 | 0.715 0 | 1.476 5 | 100.98 | |||
| 0.100 4 | 0.753 0 | 0.715 0 | 1.477 0 | 101.26 | |||
| 0.100 5 | 0.754 8 | 0.715 0 | 1.473 8 | 100.56 | |||
| 0.100 7 | 0.755 3 | 0.715 0 | 1.477 3 | 100.98 | |||
| 0.100 9 | 0.756 8 | 0.715 0 | 1.473 8 | 100.28 | |||
| 柚皮苷 | 0.100 7 | 7.663 3 | 7.611 3 | 15.494 6 | 102.89 | 102.82 | 1.0 |
| 0.100 6 | 7.655 7 | 7.611 3 | 15.460 3 | 102.54 | |||
| 0.100 4 | 7.640 4 | 7.280 8 | 15.259 0 | 104.64 | |||
| 0.100 5 | 7.648 1 | 7.280 8 | 15.124 0 | 102.68 | |||
| 0.100 7 | 7.663 3 | 7.658 4 | 15.437 3 | 101.51 | |||
| 0.100 9 | 7.678 5 | 7.658 4 | 15.542 1 | 102.68 | |||
| 橙皮苷 | 0.100 7 | 0.453 2 | 0.487 0 | 0.930 1 | 97.92 | 97.81 | 0.4 |
| 0.100 6 | 0.452 7 | 0.487 0 | 0.928 0 | 97.60 | |||
| 0.100 4 | 0.451 8 | 0.487 0 | 0.931 0 | 98.40 | |||
| 0.100 5 | 0.452 3 | 0.487 0 | 0.927 0 | 97.48 | |||
| 0.100 7 | 0.453 2 | 0.487 0 | 0.931 0 | 98.12 | |||
| 0.100 9 | 0.454 1 | 0.487 0 | 0.928 0 | 97.32 | |||
| 新橙皮苷 | 0.100 7 | 4.209 3 | 4.321 0 | 8.421 0 | 97.47 | 98.72 | 1.3 |
| 0.100 6 | 4.205 1 | 4.321 0 | 8.386 1 | 96.78 | |||
| 0.100 4 | 4.196 7 | 4.370 2 | 8.567 3 | 100.01 | |||
| 0.100 5 | 4.200 9 | 4.370 2 | 8.522 2 | 98.88 | |||
| 0.100 7 | 4.209 3 | 4.900 5 | 9.104 4 | 99.89 | |||
| 0.100 9 | 4.217 6 | 4.900 5 | 9.083 3 | 99.29 |
2.5.5 样品测定
分别取生枳壳、麸炒枳壳、制枳壳各15批，按2.5.2项下方法制备样品溶液，按2.5.1项下色谱条件进样分析，测定各成分含量，见表2。结果表明与生枳壳相比，麸炒枳壳的芸香柚皮苷和橙皮苷质量分数明显上升，提高率分别为65.03%及81.77%，柚皮苷质量分数下降率14.75%，新橙皮苷含量变化不明显；制枳壳的柚皮苷质量分数下降率20.45%，橙皮苷质量分数提高率33.92%，芸香柚皮苷与新橙皮苷变化不明显。
| 成分 | 生品 | 麸炒品 | 制品 |
|---|---|---|---|
| 芸香柚皮苷 | 0.574 7 | 0.948 4 | 0.605 3 |
| 柚皮苷 | 5.986 3 | 5.103 4 | 4.762 3 |
| 橙皮苷 | 0.302 2 | 0.549 3 | 0.404 7 |
| 新橙皮苷 | 3.574 7 | 3.533 7 | 3.264 9 |
3 讨论
本实验通过HPLC建立了枳壳及其炮制品的指纹图谱，解决了文献报道中色谱方法存在的分析时间长、分离度较差等问题，所建立的方法简单可行、重复性良好。通过比较乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液和甲醇-0.3%磷酸水溶液6种流动相的色谱图，结果显示以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱时，整体色谱峰的分离度和峰型较好，出峰较均匀。为确定最佳检测波长，采用二极管阵列检测器(DAD)对样品进行全波长扫描，结果显示在283 nm处色谱峰数目较多、峰型较好、基线较平稳，故最终选择检测波长283 nm。
通过对枳壳及其炮制品的HPLC指纹图谱进行比较，发现生枳壳HPLC指纹图谱与麸炒枳壳、制枳壳HPLC指纹图谱在色谱峰数目和峰面积方面均有明显差异，与生枳壳相比，麸炒枳壳新增9个色谱峰，减少2个色谱峰，制枳壳新增4个色谱峰，减少1个色谱峰，表明枳壳所含化学成分在麸炒、发酵及蒸煮后发生了量变与质变，麸炒枳壳和制枳壳增加的成分可能与缓和药性、增强和胃消食等功效有关，后续将通过对其进行谱效关系分析加以确定。通过对枳壳及其炮制品中4种黄酮类成分的含量变化进行分析，发现样品中柚皮苷与新橙皮苷含量均高于芸香柚皮苷与橙皮苷。与生枳壳相比，麸炒枳壳与制枳壳中芸香柚皮苷及橙皮苷的含量均升高，柚皮苷与新橙皮苷含量则均降低，表明枳壳指标性成分的含量在炮制前后发生了一定程度的变化，枳壳炮制前后功效的变化与4种黄酮类成分含量的变化是否存在相关性还需药效学实验进一步研究。
本实验建立的枳壳及其炮制品的HPLC指纹图谱及4种黄酮类成分的含量测定方法可为枳壳及其炮制品的质量评价提供有益借鉴，初步揭示了枳壳炮制前后成分种类及含量的变化规律，为枳壳及其炮制品的质量评价及临床精准使用提供了实验依据，但关于炮制前后功效变化与成分之间的关系尚需后期实验进一步研究。
Role of Quzhou Fructus Aurantii extract in preventing and treating acute lung injury and inflammation
[J]．Sci Rep，2018，doi：10.1038/s41598-018-20083-z.