肉桂其性辛、甘、热，归肾、脾、心、肝经，具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经脉的功能。现代沿用的很多传统复方、中成药中都含有肉桂，如金匮肾气丸、右归丸、桂附理中丸、滋肾通关丸，回阳救急汤等。目前许多文献研究指出肉桂具有降血糖、消炎、镇痛、抗肿瘤、抗溃疡、健胃、保护心肌等作用。肉桂对于冠心病胸痛、失眠、牙周炎和慢性胃炎都有很好的治疗效果[1]。因此，肉桂的质量监控是确保其药效的关键因素。
挥发油是肉桂的主要有效成分，体积分数约0.3～0.5 mL·g-1，且主要以肉桂醛(cinnamyldldehyde)为主，约为17.1%～73.9%[2]，已被2015年版《中国药典》收录作为肉桂质量控制的主要指标性成分。挥发油中含肉桂酸，肉桂醇，香豆素，乙酸桂皮酯，乙酸苯丙酯，苯乙烯，苯甲醛，苯丙醛，β-苯丙烯醛，β-榄香烯，α-蒎烯，α-咕巴烯，石竹烯，γ-依兰油烯，α-依兰油烯等[2]。目前使用HPLC，GC-MS方法对肉桂的质量控制研究较多[2-3]，但分析过程耗时耗力，不适用于工厂大批量药材的快速分析，缺乏通用性[4-5]。
近红外是指一种介于可见光和中红外光之间，波长在780～2 526 nm的电磁波，是在吸收光谱中被发现非可见光区[6]。近红外光谱技术利用化学键(C-H，O-H，N-H，S-H)的振动或转动以漫反射方式获得吸收光谱，结合化学计量学，建立光谱和待测成分间的线性或非线性模型，从而达到使用近红外光谱信息计算出待测成分的含量[7]。相对传统分析技术而言，近红外光谱法(NIR)具有分析速度快、分析效率高、非破坏性、分析成本低、测试稳定性好等优势[8]，此外仪器操作简单，检测灵敏度高、时间短，可实现在线同步检测、多组分同时检测等特点，因此在中药研究领域得到广泛的应用[9-14]。本实验采用近红外光谱技术，在使用HPLC测定肉桂中香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛含量的基础上，结合偏最小二乘法(PLS)建立以上4种成分的快速定量分析模型，可用于肉桂中这4种成分的快速同步测定，为实现肉桂饮片质量的快速评价提供依据。
1 材料
LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，TANGO傅里叶变换近红外光谱仪[德国布鲁克(北京)科技有限公司])，SQP型1/10万电子天平(赛多利斯)，ME104/02型1/1万电子天平(梅特勒-托利多)。OPUS软件(Bruker公司)。
香豆素(批号CHB151013，纯度98.08%)，肉桂醇(批号CHB151125，纯度98.28%)，肉桂醛(批号CHB150302，纯度99.70%)购于成都曼思特生物科技公司；肉桂酸(批号110786-200503，纯度99.20%)购于中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱级，纯度99.9%)，磷酸(色谱纯)，甲醇(分析纯)。
肉桂饮片共86批，分别购于广东、广西、云南、江西、四川、福建等正规的中药材市场或种植地，经广东药科大学中药学院刘基柱老师鉴定，均为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia的干燥树皮。见表1。
| 编号 | 产地 | 编号 | 产地 |
|---|---|---|---|
| fc1～fc10 | 广西防城 | sc1～sc10 | 四川南充 |
| gp1～gp10 | 广西桂平 | wz1～wz9 | 广西梧州 |
| hz1～hz10 | 广西贺州 | gy1～gy9 | 广东高要 |
| fj1～fj10 | 福建南安 | yn1～yn9 | 云南河口 |
| jx1～jx9 | 江西抚州 |
2 方法与结果
2.1 HPLC分析
2.1.1 供试品溶液的制备
称取肉桂粉末(过三号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率350 W，频率35 kHz)10 min，放置过夜，同法超声处理一次，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过即得。进样前用0.22 μm的微孔滤膜过滤[15]。
2.1.2 对照品溶液的制备
分别取香豆素、肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛4种对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成香豆素的质量浓度204.8 mg·L-1，肉桂醇质量浓度217.8 mg·L-1，肉桂酸质量浓度209 mg·L-1，肉桂醛质量浓度199.6 mg·L-1单对照品溶液。经稀释混合后制得质量浓度分别为香豆素4.10 mg·L-1，肉桂醇4.36 mg·L-1，肉桂酸8.36 mg·L-1，肉桂醛4.0 mg·L-1的混合对照品溶液。
2.1.3 色谱条件
流动相乙腈-0.1%磷酸水(28∶72)；检测波长254 nm。流速1.0 mL·min-1，柱温35 ℃，进样量10 μL。以肉桂醛峰计理论塔板数应不能低于3 000。
2.2 近红外光谱采集
取样品粉末(过3号筛)适量，装样于旋转样品杯内，摊平，压实，以空气为空白参比扣除背景(每测定一种肉桂粉末，均要以空气为空白参比测试背景)，采集光谱图。采集方式漫反射；扫描次数32次；分辨率8 cm-1；采集光谱区间11 528～3 952 cm-1；每个样品采集3次，取平均作为测试光谱。所采集的光谱数据通过OPUS软件求均值处理。
2.3 统计分析
采用化学计量学软件OPUS对光谱进行预处理，采用TQ Analyst软件建立PLS校正模型。
2.4 检测与数据分析
2.4.1 HPLC分析
按2.1.3项下色谱条件测定，HPLC色谱图见图1。
将不同产地肉桂以2.1.3项下的色谱条件进行含量测定，计算出不同产地肉桂中香豆素、肉桂醇、肉桂酸和肉桂醛的含量，均符合2015年版《中国药典》项下含量要求。其平均值依次为0.073 4%，0.043 5%，0.069 2%，16.865 5%。
2.4.2 近红外光谱采集
在2.2项下近红外光谱测定条件下，采集86批不同产地肉桂近红外光谱，重复测定3次，平均光谱见图2。由图2可见，不同产地肉桂的近红外光谱基本一致，但产地之间存在一定的差异。
2.4.3 校正集与验证集划分
随机抽取61批不同产地肉桂建立香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛的近红外定量校正模型，见表2，余下25批验证模型用。验证集样品中香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛含量均在校正集含量范围内，此校正集与验证集可用于建模。
| 成分 | 校正集(n＝61) | 验证集(n＝25) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 质量分数 | 平均值 | RSD | 质量分数 | 平均值 | RSD | |
| 香豆素 | 0.017 9～0.174 6 | 0.073 4 | 56.5 | 0.018 1～0.152 5 | 0.075 7 | 55.5 |
| 肉桂醇 | 0.006 2～0.109 2 | 0.043 5 | 68.8 | 0.009 5～0.089 2 | 0.047 1 | 55.1 |
| 肉桂酸 | 0.037 1～0.976 0 | 0.069 2 | 23.3 | 0.043 3～0.092 1 | 0.072 1 | 16.8 |
| 肉桂醛 | 6.046 9～32.493 3 | 16.865 5 | 40.9 | 6.242 8～28.425 8 | 18.428 2 | 36.6 |
2.4.4 波段选择
采用OPUS软件自带的优化设置，筛选出最佳建模波段为11 528～3 952 cm-1。
2.4.5 NIR光谱预处理
定量模型的多元校正方法有多元回归(MLR)，主成分回归(PCR)，偏最小二乘法(PLS)等。不同的多元校正方法各有优缺，本实验选取PLS作为校正方法，以相关系数(r)，校正均方差(RMSEC)，预测均方差(RMSEP)为指标，考察了标准正态变换(SNV)，多元散射校正(MSC)，平滑去噪法(移动平均平滑法和Savitzky-Golay卷积平滑法)，一阶导数法(1st derivative)，二阶导数法(2st derivative)等预处理方法。其中R越接近1，RMSEC和RMSEP越接近0，模型的性能越稳定。比较了SNV和MSC对4种指标性成分模型的影响，见表3。综合考虑取SNV对香豆素、肉桂醇光谱进行预处理，取MSC对肉桂酸、肉桂醛光谱进行预处理。
| 预处理方法 | 指标成分 | R | RMSEC | RMSEP |
|---|---|---|---|---|
| SNV | 香豆素 | 0.952 8 | 0.012 2 | 0.017 8 |
| 肉桂醇 | 0.977 7 | 0.006 1 | 0.010 3 | |
| 肉桂酸 | 0.959 7 | 0.004 4 | 0.006 5 | |
| 肉桂醛 | 0.991 9 | 0.836 0 | 1.610 0 | |
| MSC | 香豆素 | 0.949 1 | 0.012 6 | 0.017 8 |
| 肉桂醇 | 0.976 5 | 0.006 3 | 0.011 3 | |
| 肉桂酸 | 0.961 9 | 0.004 3 | 0.005 5 | |
| 肉桂醛 | 0.992 2 | 0.820 0 | 1.630 0 |
2.4.6 主因子数确定
确定最佳主因子数的方法是以RMSECV对主因子数作图，为避免模型拟合不充分或过度，RMSECV值应随主因子数增加而递减，当RMSECV值达到最低值后出现细微上升或平滑下降。香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛定量模型最佳主因子数分别为7，10，10，10，RMSECV值依次为0.015 8，0.011 2，0.002 0，1.481 1 g·g-1。
2.4.7 定量模型的建立与验证
运用TQ分析软件，采用偏最小二乘法，预处理为SNV，MSC，建模波段为11 528～3 952 cm-1，香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛定量模型最佳主因子数分别为7，10，10，10，随机抽取61批不同产地肉桂建立香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛的近红外定量校正模型。模型质量评价参数r依次为0.952 8，0.977 7，0.961 9，0.992 2，RMSEC依次为0.012 2，0.006 1，0.004 3，0.82 g·g-1，RMSEP依次为0.017 8，0.010 3，0.005 5，1.63 g·g-1，RMSECV依次为0.015 8，0.011 2，0.002 0，1.481 1 g·g-1。R接近于1，RMSEC，RMSEP接近于0，说明模型预测值与参考值之间存在良好的相关性。
应用定量模型，对未参与建模的25批肉桂样品进行预测，模型预测值与参考值的相对拟合误差接近于0，表明该模型稳定可靠，具有良好的预处能力，见图3。对香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛模型预测值与参考值进行配对t检验，P依次为0.117，0.610，0.121，0.541，均>0.05，光谱预测值与参考值之间无显著差异，表明近红外光谱法与HPLC法之间系统误差小，可忽略不计。
3 讨论
采用偏最小二乘法建立不同产地肉桂香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛的定量校正模型，并对未参与建模的25批样品进行预测，得相对拟合误差接近0，表明模型稳健，可靠性良好。配对t检验显示预测值与参考值之间无显著差异，表明近红外光谱法与高效液相色谱法之间没有明显系统误差。其中香豆素的相对偏差较其他3个成分略大，猜测可能与香豆素的化学结构和含量有关。
HPLC作为目前肉桂质量监控的药典检测方法，其样品处理复杂，耗时较长。本研究以肉桂为研究对象，建立不同产地肉桂的近红外定量校正模型，模型稳定可靠，可用于对未知样品的预测。与HPLC相比，能快速简便准确地预测不同产地肉桂中香豆素、肉桂醇、肉桂酸、肉桂醛的含量，节省大量的时间、经费，缩减工作量。近红外光技术在一定程度上可以代替HPLC分析工作，为后续建立肉桂质量品质的数字化标准提供参考，但还需更多研究者进一步研究证明。
