过山蕨，又名马蹬草、还阳草、过桥草，为铁角蕨科(Aspleniaceae)过山蕨属(Camptosorus)植物过山蕨(Camptosorus sibiricus)的地上全草。生于海拔300～2 000 m的阴坡灌丛下、岩石上或溪沟旁，主产于我国东北、华北、西北、内蒙古、山东及江苏北部等地，亦分布于朝鲜、日本及俄罗斯远东地区。过山蕨为民间用药，药用部位为地上全草，具有活血化瘀，止血，解毒等功效，临床上用于治疗血栓闭塞性脉管炎、子宫出血及神经性皮炎等，河南地区用于治疗肝癌及肝硬化等[1]。目前研究过山蕨的主要有效部位为总黄酮，其对兔耳血管、蟾蜍后肢血管以及家兔在体后肢血管有扩张作用；对化学物质、药物、乙醇等引起的脂肪性肝损伤有保护作用，能明显抑制转氨酶升高，改善肝组织病理状态[2]。另有研究发现其具有解除体表皮肤黏膜血管和骨骼肌血管痉挛，抗去甲肾上腺素、抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集；对小鼠肺癌有预防作用，阻止小鼠肺癌的转移和术后复发，在致癌的肺组织中能够降低毛细血管的通透性，显示出良好的肿瘤血管正常化作用等[3-4]。
目前为止，国内外对过山蕨化学成分和生物活性研究报道较少，主要是黄酮、有机酸及皂苷类化合物，且其药效物质基础尚不明确[5-6]。文献研究发现过山蕨的提取方式多为乙醇或者甲醇加热回流提取，本课题采取水提取方式获取粗提物，再通过多种色谱分离技术对水提取物进行分离，运用多种波谱检测技术对分离出的化合物进行结构鉴定，从探索新资源的角度出发对过山蕨化学成分进行系统的研究，期望能够获得结构新颖且活性较好的单体化合物，为阐明其药效提供物质基础，促进过山蕨的合理开发利用。对过山蕨水提取的正丁醇萃取物进行系统的化学成分研究，从中分离得到10个化合物，分别鉴定为(7E)-9-hydroxymegastigma-4，7-dien-3-on-9-O-β-D-glucoside(1)，bridelionoside F(2)，(3R，5S，6S，7E，9S)-megastigman-7-ene-3，5，6，9-tetrol 9-O-β-D-glucopyranoside(3)，(6S，7E，9R)-roseoside(4)，(3S，5S，6R，9R)-3-hydroxy-5，6-epoxy-β-ionol-9-O-β-glucopyranoside(5)，6，9-dihydroxy-4，7-megastigmadien-3-one(6)，elaphoside A(7)，ptelatoside-A(8)，n-butyl-α-β-D-fructofuranoside(9)，dibutylphthalate(10)。
1 材料
MCP 500型旋光光谱仪(Anton paar)；V-550型紫外-可见光谱仪，FI/IR-480 Plus Fourier Transform型红外光谱仪(Jasco)；AV-400型质谱仪(瑞士Bruker公司)；LC-6AD型半分析半制备液相色谱仪(岛津企业管理有限公司)；COSMOSIL 5PYE Packed Column(10 mm×250 mm，Nacalai Tesque公司)；1290型超高效液相色谱仪，6540四级杆串联飞行时间质谱(美国安捷伦科技公司)；KQ5200B型超声波清洗器(广州浩瀚仪器有限公司)；AL-204型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。
ODS(日本YMC公司生产)，柱色谱与薄层色谱用硅胶(青岛海洋化工厂生产)，LH-20型羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20，美国Pharmacia公司)，甲醇(色谱级，山东禹王公司产品)，乙腈(美国默克公司)，其他分析试剂均来自天津光华科技股份有限公司。
过山蕨于2013年7月采自河南省郑州市，由暨南大学药学院周光雄教授鉴定为铁角蕨科植物过山蕨(Camptosorus sibiricus)的地上全草，标本保存在广州中医药大学国际中医药转化医学研究所。
2 提取分离
取干燥的过山蕨地上全草5.0 kg，用15倍量的水煎煮提取，待水沸腾后持续30 min，倒出药液，重复此过程3次，合并药液。提取液真空减压浓缩，得到总浸膏约1.067 kg。取总浸膏980 g用正丁醇萃取，得到正丁醇萃取部位的浸膏120 g。取正丁醇部位的浸膏107 g，用硅胶200 g(60～100目)拌样，硅胶1 kg (200～300目)为色谱硅胶，二氯甲烷-甲醇(1∶0～0∶1)梯度洗脱，TLC检测分析合并得到10个部分Fr.F～Fr.O。Fr.L经ODS柱色谱甲醇-水(1∶0～0∶1)梯度洗脱，40%甲醇水冲洗下来的流分过凝胶柱纯化，再经HPLC(35%甲醇水，tR 56.1 min)得到化合物1(10.0 mg)，Fr.K经ODS柱色谱甲醇-水(1∶0～0∶1)梯度洗脱，40%甲醇水冲洗下来的流分过凝胶柱纯化，再经HPLC(20%甲醇水，tR 109.0 min)得到化合物2(17.4 mg)，Fr.J经ODS柱色谱甲醇-水(1∶0～0∶1)梯度洗脱，30%甲醇水冲洗下来的流分过凝胶柱纯化得到2个部分A和B，部分A再经HPLC(23%甲醇水，tR 53.4，63.7，83.34，102.6 min)分别得到化合物3(34.0 mg)，4(10.0 mg)，5(180.0 mg)，6(30.0 mg)，部分B再经HPLC(80%甲醇水，tR 38.7 min)得到化合物9(59.5 mg)，Fr.I经过凝胶柱纯化，再经HPLC(32%甲醇水，tR 31.9，39.2 min)分别得到化合物7(3.0 mg)，8(3.5 mg)，Fr.N经HPLC(80%甲醇水，tR 33.2 min)得到化合物10(2.8 mg)。
3 结构鉴定
化合物1 无色油状，HR-ESI-MS m/z 371.206 8[M＋H]＋。分子式为C19H30O7，不饱和度Ω＝5。IR谱显示有羟基吸收(3 326 cm-1)，双键吸收(1 654 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)，δ：1.96(1H，d，J＝16.4 Hz，H-2ep)，2.36(1H，d，J＝16.4 Hz，H-2ax)，5.79(1H，s，H-4)，2.61(1H，d，J＝8.8 Hz，H-6)，5.57(1H，dd，J＝15.2，6.4 Hz，H-7)，5.68(1H，dd，J＝15.6，9.2 Hz，H-8)，4.29(1H，m，H-9)，1.19(3H，d，J＝6.0 Hz，H-10)，0.93(3H，s，H-11)，0.91(3H，s，H-12)，1.85(3H，s，H-13)，4.18(1H，d，J＝8.0 Hz，H-1 of Glc)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)，δ：35.9(C-1)，47.4(C-2)，198.2(C-3)，125.1(C-4)，162.3(C-5)，54.8(C-6)，127.5(C-7)，136.9(C-8)，74.9(C-9)，21.0(C-10)，27.0(C-11)，27.6(C-12)，23.2(C-13)，101.1(C-1′)，73.9(C-2′)，77.0(C-3′)，70.1(C-4′)，77.0(C-5′)，61.2(C-6′)。以上数据与文献[7]报道的降倍半萜(7E)-9-hydroxymegastigma-47-dien-3-on-9-O-β-D-glucoside一致，故确定该化合物为(7E)-9-hydroxymegastigma-4，7-dien-3-on-9-O-β-D-glucoside，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物2 无色油状，HR-ESI-MS m/z 411.199 3[M＋Na]＋。分子式为C19H32O8，不饱和度Ω＝4。IR谱显示有羟基吸收(3 374 cm-1)，双键吸收(1 641 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR谱(400 MHz，CD3OD)，δ：1.37，1.87(2H，H-2)，3.86(1H，m，H-3)，3.88(1H，m，H-4)，6.11(1H，d，J＝16.0 Hz，H-7)和5.62(1H，dd，J＝16.0，8.0 Hz，H-8)，4.45(1H，m，H-9)，1.37(3H，d，J＝8.0 Hz，H-10)，1.11(3H，s，H-11)，1.07(3H，s，H-12)，1.87(3H，s，H-13)，4.43(1H，d，J＝8.0 Hz，H-Glc-1)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)，δ：37.9(C-1)，41.8(C-2)，68.1(C-3)，72.7(C-4)，129.3(C-5)，142.3(C-6)，128.8(C-7)，138.6(C-8)，78.0(C-9)，21.2(C-10)，28.0(C-11)，30.5(C-12)，20.1(C-13)，102.6(C-1′)，75.5(C-2′)，78.2(C-3′)，71.5(C-4′)，78.1(C-5′)，62.6(C-6′)。以上数据与文献[8]报道的bridelionoside F一致，故确定该化合物为bridelionoside F，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物3 无色油状，HR-ESI-MS m/z 415.211 9[M＋K]＋。分子式为C19H34O9，不饱和度Ω＝3。IR谱显示有羟基吸收(3 277 cm-1)，双键吸收(1 655 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：1.25(1H，dd，J＝10.4，3.6 Hz，H-2ep)，1.48(1H，m，H-2ax)，3.64(1H，m，H-3)，1.57(1H，m，H-4)，5.97(1H，d，J＝16.0 Hz，H-7)和5.72(1H，dd，J＝16.0，7.6 Hz，H-8)，4.25(1H，m，H-9)，1.20(3H，d，J＝6.0 Hz，H-10)，0.73(3H，s，H-11)，1.05(3H，s，H-12)，1.01(3H，s，H-13)，4.15(1H，d，J＝7.6 Hz，H-Glc-1)。13C-NMR谱(100 MHz，DMSO-d6)，δ：40.5(C-1)，45.8(C-2)，62.8(C-3)，45.2(C-4)，75.9(C-5)，77.0(C-6)，132.8(C-7)，131.8(C-8)，76.3(C-9)，21.5(C-10)，27.1(C-11)，27.2(C-12)，25.8(C-13)，100.9(C-1′)，73.8(C-2′)，76.7(C-3′)，70.3(C-4′)，77.0(C-5′)，6(C-6′)。以上数据与文献[9]报道的(3R，5S，6S，7E，9S)-megastigman-7-ene-3，5，6，9-tetrol 9-O-β-D-glucopyranoside一致，故确定该化合物为(3R，5S，6S，7E，9S)-megastigman-7-ene-3，5，6，9-tetrol 9-O-β-D-glucopyranosid，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物4 无色油状，HR-ESI-MS m/z 387.201 4 [M＋H]＋。分子式为C19H30O8，不饱和度Ω＝5。IR显示有羟基吸收(3 388 cm-1)，双键吸收(1 653 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：2.05(1H，d，J＝16.8 Hz，H-2ep)，2.42(1H，d，J＝16.8 Hz，H-2ax)，5.79(1H，d，J＝8.8 Hz，H-4)，5.76(1H，d，J＝15.6 Hz，H-7)，5.74(1H，dd，J＝15.6，5.6 Hz，H-8)，4.33(1H，m，H-9)，1.18(3H，d，J＝6.4 Hz，H-10)，1.81(3H，s，H-11)，0.93(3H，s，H-12)，0.92(3H，s，H-13)，4.17(1H，d，J＝8.0 Hz，H-Glc-1)。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：40.9(C-1)，49.4(C-2)，197.4(C-3)，125.7(C-4)，164.0(C-5)，77.9(C-6)，130.3(C-7)，133.2(C-8)，74.6(C-9)，20.9(C-10)，18.9(C-11)，23.0(C-12)，24.1(C-13)，100.9(C-1′)，73.7(C-2′)，76.8(C-3′)，70.0(C-4′)，76.8(C-5′)，61.1(C-6′)。以上数据与文献[10]报道的(6S，7E，9R)-roseoside一致，故确定该化合物为(6S，7E，9R)-roseoside，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物5 黄色油状，HR-ESI-MS m/z 411.199 2 [M＋Na]＋。结分子式为C19H32O8，不饱和度Ω＝4。IR显示有羟基吸收(3 361 cm-1)，双键吸收(1 662 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：1.53，1.44(2H，H-2)，3.16(1H，m，H-3)，2.16，1.43(2H，H-4)，5.87(1H，d，J＝15.6 Hz，H-7)，5.56(1H，dd，J＝15.6，6.8 Hz，H-8)，3.59(1H，m，H-9)，1.17(3H，d，J＝6.0 Hz，H-10)，0.85(3H，s，H-11)，1.10(3H，s，H-12)，1.05(3H，s，H-13)，4.17(1H，d，J＝7.6 Hz，H-Glc-1)。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：34.3(C-1)，46.9(C-2)，62.0(C-3)，40.7(C-4)，65.9(C-5)，68.7(C-6)，126.3(C-7)，135.4(C-8)，74.5(C-9)，20.7(C-10)，19.8(C-11)，24.7(C-12)，29.4(C-13)，101.0(C-1′)，73.7(C-2′)，76.8(C-3′)，69.7(C-4′)，76.8(C-5′)，60.7(C-6′)。以上数据与文献[11]报道的(3S，5S，6R，9R)-3-hydroxy-5，6-epoxy-β-ionol-9-O-β-glucopyranoside一致，故确定该化合物为(3S，5S，6R，9R)-3-hydroxy-5，6-epoxy-β-ionol-9-O-β-glucopyranoside，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物6 黄色油状，HR-ESI-MS m/z 225.149 5 [M＋H]＋。分子式为C13H20O3，不饱和度Ω＝4。IR显示有羟基吸收(3 366 cm-1)，双键吸收(1 663cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：2.36(1H，d，J＝16.4 Hz，H-2ep)，2.06(1H，d，J＝16.4 Hz，H-2ax)，5.77(1H，s，H-4)，5.64(1H，d，J＝16.0 Hz，H-7)和5.68(1H，dd，J＝16.0，4.4 Hz，H-8)，4.18(2H，m，H-9)，1.11(3H，d，J＝6.0 Hz，H-10)，0.91(3H，s，H-11)，0.93(3H，s，H-12)，1.81(3H，s，H-13)，4.89(1H，s，6-OH)，4.71(1Hs，9-OH)。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：40.9(C-1)，49.3(C-2)，197.4(C-3)，125.5(C-4)，164.4(C-5)，77.8(C-6)，135.9(C-7)，127.9(C-8)，66.1(C-9)，24.1(C-10)，23.9(C-11)，23.0(C-12)，19.0(C-13)。以上数据与文献[12]报道的6，9-dihydroxy-4，7-megastigmadien-3-one一致，故确定该化合物为6，9-dihydroxy-4，7-megastigmadien-3-one，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物7 黄色粉末，HR-ESI-MS m/z 467.152 4 [M＋Na]＋。分子式为C20H28O11，不饱和度Ω＝6。IR显示有羟基吸收(3 390 cm-1)，双键吸收(1 655 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：6.67(1H，dd，J＝17.6，11.6 Hz，H-7)，5.69(1H，d，J＝17.6 Hz，H-8)，5.13(1H，d，J＝11.6 Hz，H-8)，7.38(2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6)，7.03(2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5)，4.97(1H，d，J＝7.2 Hz，H-Glc-1′)，4.48(1H，d，J＝8 Hz，H-Glc-1′′)分别为2个葡萄糖的端基碳信号，根据其耦合常数证明D-葡萄糖均为β-构型。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：157.1(C-1)，116.5(C-2，6)，127.1(C-3，5)，131.0(C-4)，136.1(C-7)，112.3(C-8)，99.0(C-1′)，76.2(C-2′)，82.9(C-3′)，69.4(C-4′)，74.9(C-5′)，60.6(C-6′)，104.7(C-1″)，76.9(C-2″)，77.0(C-3″)，69.6(C-4″)，75.9(C-5″)，60.6(C-6″)。以上数据与文献[13]报道的elaphoside A一致，故确定该化合物为elaphoside A，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物8 黄色油状，HR-ESI-MS m/z 437.142 2 [M＋Na]＋。分子式为C19H26O10，不饱和度Ω＝6。IR谱显示有羟基吸收(3 344 cm-1)，双键吸收(1 669 cm-1)的特征吸收峰。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：7.40(1H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6)，7.03(1H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5)，6.65(1H，dd，J＝17.6，11.2 Hz，H-7)，5.68(1H，d，J＝17.6 Hz，H-8)，δH 5.14(1H，d，J＝11.2 Hz，H-8)，4.81(1H，d，J＝7.2 Hz，H-Glc-1′)，4.17(1H，d，J＝6 Hz，H-Glc-1″)分别为两个糖的端基氢质子信号，根据其耦合常数证明D-葡萄糖均为β-构型。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：157.2(C-1)，116.4(C-2)，127.3(C-3)，130.9(C-4)，127.3(C-5)，116.4(C-6)，136.1(C-7)，112.3(C-8)，100.4(C-1′)，73.2(C-2′)，76.5(C-3′)，69.9(C-4′)，75.8(C-5′)，68.0(C-6′)，103.3(C-1″)，70.6(C-2″)，72.5(C-3″)，67.3(C-4″)，64.9(C-5″)。以上数据与文献[14]报道的ptelatoside-A一致，故确定该化合物为ptelatoside-A，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物9 无色油状。HR-ESI-MS m/z 275.278 3 [M＋K]＋。分子式为C10H20O6，不饱和度Ω＝1。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ：3.95(2H，m，H-1)，1.55(2H，m，H-2)和1.41(2H，m，H-3)，0.94(3H，dd，J＝7.2，2.8 Hz，H-4)。13C-NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ：62.1(C-1)，33.6(C-2)，20.5(C-3)，14.5(C-4)，105.3(C-1′)，83.5(C-2′)，78.6(C-3′)，77.5(C-4′)，65.1(C-5′)，62.3(C-6′)。以上数据与文献[15]报道的n-butyl-a-β-D-fructofuranoside一致，故确定该化合物为n-butyl-a-β-D-fructofuranoside，该化合物首次从该属植物中分离得到。
化合物10 无色油状。分子式为C16H22O4，不饱和度Ω＝6。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)，δ：7.62(2H，dd，J＝6.0，3.6 Hz，H-2，5)，7.72(2H，dd，J＝6.0，3.6 Hz，H-3，6)，4.29(4H，t，J＝6.4 Hz，H-8，8′)，1.72(4H，m，H-9，9′)，1.46(4H，m，H-10，10′)，0.98(6H，t，J＝7.6 Hz，H-11，11′)。13C-NMR(100 MHz，CD3OD)，δ：133.7(C-1)，133.7(C-2)，130.0(C-3)，132.5(C-4)，132.5(C-5)，130.0(C-6)，169.5(C-7)，66.8(C-8)，31.9(C-9)，20.4(C-10)，14.2(C-11)，169.5(C-7′)，66.8(C-8′)，31.9(C-9′)，20.4(C-10′)，14.2(C-11′)。以上数据与文献[16]报道的dibutylphthalate一致，故确定该化合物为dibutylphthalate，该化合物首次从该属植物中分离得到。
4 讨论
从过山蕨水提物中分离得到10个化合物，根据其理化性质和波谱数据对这些化合物进行分析鉴定，化合物1～6为6个降倍半萜类化合物，化合物7和8为苯乙烯双糖苷，化合物9为正丁基呋喃果糖苷，化合物10为邻苯二甲酸二丁酯，所有化合物均首次从该植物中分离得到。本课题首次从过山蕨中分离出系列萜类成分，可能与提取方式为水煎煮和正丁醇萃取方式有关。过山蕨为民间用药，文献报道的化合物类型和数量较少，以往药理研究集中在总黄酮，有效成分也不能完全确认。因此，对过山蕨化学成分进行全面深入地研究，力争发掘出更多的活性成分，对于药用价值的发现及新药开发具有重大意义。
