陈皮是芸香科植物橘(Citrus reticulata)及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]。药材分为“陈皮”和“广陈皮”。经由采摘成熟果实、剥取果皮、晒干或低温干燥后得到。陈皮主要含有黄酮和挥发油两大类成分[2]，具有抗炎、抗氧化及营养神经的作用[3-5]。Ho等[6]用LC-MS分析了陈皮乙醇提取物的成分，证明了陈皮中的黄酮类化合物具有较强的抗神经炎症作用。而陈皮更多的是以水提取液入药，如陈皮配方颗粒、二陈汤等。陈皮水溶性成分有橙皮苷、芸香柚皮苷、川陈皮素、橘皮素等[7]，且陈皮水提液有较强的体内外抗氧化效果，具有显著的抗缺氧、抗疲劳、降血糖作用[8-10]。目前对陈皮水提物的药物机制研究较多[11-14]，而其化学成分的报道较少。糖尿病性脑病是中枢神经系统(CNS)中较为严重的糖尿病相关并发症[15]，以认知功能受损、神经化学和结构异常为特征[16]，糖尿病所引发的认知功能障碍的患病率为25%～36%[17]。目前糖尿病脑病的病理生理机制尚不明确[18]，其药物治疗仍处于摸索阶段[19]，药物治疗的主要原则为控制血糖和改善学习记忆能力，但这些药对糖尿病认知功能障碍的临床疗效还有待研究。张红蕊等[20]研究发现，陈皮提取物川陈皮素具有抗氧化应激和抑制凋亡的作用，进而改善糖尿病大鼠的学习和记忆能力。但陈皮水提物对糖尿病大鼠认知能力的影响鲜有报道，也尚未有陈皮水提物指纹图谱与药效相结合的研究，因此本研究采用HPLC建立陈皮水提物中香草酸、原儿茶酸、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素的指纹图谱，结合化学计量学对21批陈皮提取物进行分析，并研究陈皮水提物对糖尿病认知功能大鼠的改善作用，进而结合灰色关联度分析及最小偏二乘回归分析研究其指纹图谱与认知能力的谱效关系。
1 材料
1100型高效液相色谱仪(包括色谱工作站)，Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(美国安捷伦科技有限公司)；AL-104型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，移液枪(德国Eppendorf公司)，恒温水浴锅(上海赫田科学仪器有限公司)，水浴恒温振荡器(常州中诚仪器制造有限公司)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，血糖仪及血糖试纸[强生(中国)医疗器材有限公司]，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。
香草酸、原儿茶酸、橙皮苷、川陈皮素、橘皮素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为Y26M7C15276，Z30M6L1，M03J8S39169，H22M8K32109，H09M7K14409，纯度均>98%)；乙腈(色谱纯)，磷酸(分析纯)均购自天津科密欧试剂有限公司；水(超纯水，自制)。
动物选用SD雄性大鼠，清洁级，体质量180～220 g，由贵州医科大学动物实验中心提供，贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，合格证号为SCXK(黔)2012-0001，批准编号1702093。
21批陈皮来源见表1，以上药材均购于全国各药店，均由贵州中医药大学魏升华教授做药材鉴定，均符合2015年版《中国药典》规定。
| 样品编号 | 产地 | 品种 | 样品编号 | 产地 | 品种 |
|---|---|---|---|---|---|
| S1 | 广东新会 | 茶枝柑 | S12 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S2 | 广东新会 | 茶枝柑 | S13 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S3 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S14 | 广东新会 | 茶枝柑 |
| S4 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S15 | 江西抚州 | 蜜柑 |
| S5 | 江西南昌 | 蜜柑 | S16 | 浙江温州 | 蜜柑 |
| S6 | 江西南昌 | 蜜柑 | S17 | 江西南昌 | 蜜柑 |
| S7 | 浙江金华 | 蜜柑 | S18 | 江西莲塘 | 蜜柑 |
| S8 | 广西桂林 | 蜜柑 | S19 | 广西桂林 | 蜜柑 |
| S9 | 广东惠州 | 茶枝柑 | S20 | 广东惠州 | 茶枝柑 |
| S10 | 江西抚州 | 蜜柑 | S21 | 江西莲塘 | 蜜柑 |
| S11 | 广东惠州 | 茶枝柑 |
2 方法
2.1 色谱条件
Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)梯度洗脱(0～30 min，5%～19%A；30～40 min，19%～20%A；40～50 min，20%～29%A；50～85 min，29%～54%A)；流速1 mL·min-1；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称定川陈皮素、橘皮素、橙皮苷对照品适量，加入甲醇溶解后得到质量浓度为0.722，0.840，1.262 g·L-1的对照品贮备液；分别精密称定原儿茶酸、香草酸对照品适量，加入无水乙醇溶解后得到质量浓度分别为2.440，2.260 g·L-1的对照品贮备液。精密量取上述各对照品贮备液适量，用甲醇稀释，得到质量浓度分别为川陈皮素0.101 1 g·L-1，橘皮素0.084 g·L-1，橙皮苷0.706 7 g·L-1，原儿茶酸0.040 g·L-1，香草酸0.027 1 g·L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品的制备
称取陈皮药材粗粉2 g，过60目筛，混合均匀，精密称定于250 mL蒸馏瓶中，加入蒸馏水100 mL，并加热回流2 h，重复提取3次，过滤，合并过滤液，浓缩，加水定容至100 mL量瓶中，摇匀即得。取1 mL溶液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验
精密吸取同一批号的供试品溶液0.5 mL于进样瓶中，按照2.1项下色谱条件连续进样5次，得到25个共有峰的保留时间和峰面积，计算得到各色谱峰保留时间的RSD在0.2%～0.6%，峰面积的RSD在1.3%～3.5%，表明仪器精密度良好。
2.4.2 稳定性试验
精密吸取同一批号的供试品溶液0.5 mL于进样瓶中，按照2.1项下色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24 h进行进样，得到25个共有峰的保留时间和峰面积，计算得到各色谱峰保留时间的RSD在0.07%～0.6%，峰面积的RSD在0.5%～1.5%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验
取同一批号样品根据2.3项下方法制备供试品溶液，平行制备6份进行测定，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录25个共有峰的保留时间和峰面积，计算得到各色谱峰保留时间的RSD在0.1%～0.6%，峰面积的RSD在0.1%～3.1%，表明该方法重复性良好。
2.5 动物灌胃液的制备
取陈皮药材粗粉约1 g，过60目筛，混合均匀，精密称定于125 mL蒸馏瓶中，加入蒸馏水50 mL，并加热回流2 h，重复提取3次，过滤，合并过滤液，浓缩，作为动物实验灌胃液。
2.6 动物分组和给药
将96只雄性清洁级SD大鼠适应性喂养1周，随机分出8只为正常组，其余88只采用一次性腹腔注射STZ(50 mg·kg-1)诱导动物模型。4周后，将造模成功的大鼠随机分为11组，每组8只，分别为模型组和试验组(陈皮水提物灌胃)，模型组灌胃等体积的纯净水，其余各组给予相应的陈皮水提物，剂量按1 g·kg-1，每日1次，定时灌胃给药，连续灌胃8周。
2.7 血糖的检测
定期尾静脉采血，测定大鼠空腹血糖值。先用75%乙醇对大鼠尾部进行消毒，再以无菌采血针刺入大鼠尾部，见滴血后，用无菌棉签擦拭掉第1滴血，取第2滴血进行血糖仪测血糖，完毕后迅速用无菌棉签按压出血处。
2.8 Morris水迷宫试验
连续灌胃8周后，对大鼠进行Morris水迷宫试验，于每天的相同时间段对每只大鼠进行测试，测试时需避免室内灯光、噪声等对大鼠的干扰。试验共历时5 d，内容包括①定位航行实验，每只大鼠每天进行4次训练，每次训练时间为60 s，连续两次训练时间应间隔15 min以上，每次训练时需将大鼠从不同象限的中点处投入水中，投入时将大鼠面朝池壁轻轻投入，以免扰动水面形成水波纹，影响实验结果。大鼠从入水至找到目标平台所需的时间记为逃避潜伏期，如大鼠在规定时间内未能找到目标平台，则逃避潜伏期记为60 s，并将大鼠引导至目标平台停留10 s。②空间探索实验，实验进行至第5天，撤除平台，按上述方法将大鼠投入水中，观察大鼠的游泳轨迹并记录大鼠穿越目标平台所在象限的次数，用来判别大鼠的空间学习记忆能力。
2.9 灰色关联度分析
对获得的10批陈皮药材水提物HPLC指纹图谱共有峰峰面积数据与糖尿病大鼠的血糖值、逃避潜伏期、跨越平台次数进行灰色关联度分析，研究其相关性，参照文献[21-22]的方法和步骤对数据进行处理和分析。
2.10 偏最小二乘回归分析
以陈皮水提物HPLC谱指纹图谱25个共有峰的峰面积作为自变量，不同批次陈皮水提物对糖尿病大鼠的逃避潜伏期、跨越平台次数作为因变量，利用SIMCA 14.1软件通过偏最小二乘回归法进行谱效相关性分析。
3 结果
3.1 21批不同来源陈皮水提物指纹图谱的建立
分别取21批不同来源的陈皮药材，按照2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，按2.1项下色谱条件进样检测，记录色谱图，分别将21批陈皮水提物的HPLC数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版A)，得到21批陈皮水提物样品的指纹图谱，确定25个共有峰，见图1，图2。
3.2 21批不同来源陈皮水提物的相似度评价
分别将21批陈皮水提物的HPLC数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版A)，结果21批陈皮水提物的指纹图谱相似度均>0.93，各批次陈皮之间的相似性良好，见表2。
| 样品批号 | 相似度 | 样品批号 | 相似度 |
|---|---|---|---|
| S1 | 0.991 | S12 | 0.943 |
| S2 | 0.993 | S13 | 0.936 |
| S3 | 0.984 | S14 | 0.989 |
| S4 | 0.988 | S15 | 0.941 |
| S5 | 0.936 | S16 | 0.953 |
| S6 | 0.931 | S17 | 0.942 |
| S7 | 0.955 | S18 | 0.945 |
| S8 | 0.938 | S19 | 0.939 |
| S9 | 0.983 | S20 | 0.982 |
| S10 | 0.940 | S21 | 0.944 |
| S11 | 0.985 |
3.3 共有峰的确认
采用对照品比对的方法，经鉴定1号峰为原儿茶酸，2号峰为香草酸，3号峰为橙皮苷，4号峰为川陈皮素，5号峰为橘皮素，见图3。
3.4 聚类分析
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004版A)处理指纹图谱得到25个共有峰的峰面积，以峰面积作为变量，运用IBM SPSS Statistics version 24，分别采用组间联接、组内联接、中位数聚类和瓦尔德法进行分析，结果表明，瓦尔德法以欧式平方距离作为度量标准距离对陈皮水提物进行聚类分析，通过21批陈皮水提物聚类分析树状图发现，距离度量为10时，样品被分2类，距离度量为5时被分为3类。根据聚类分类情况，品种茶枝柑和蜜柑明显分为两类，且两类的相似度有所差异，茶枝柑相似度在0.982～0.993，蜜柑的相似度在0.931～0.955，产地之间的差异较小，对比指纹图谱软件得出的相似度结果，与相似度结果相符，见图4。
3.5 主成分分析
采用SPSS统计软件(IBM SPSS Statistics version 24)和SIMCA-P 14.1统计软件对21批不同来源的陈皮水提物指纹图谱数据进行主成分分析(PCA)，SPSS主成分分析组件图，见图5。
3.5.1 特征值、方差贡献率
通过SPSS统计软件(IBM SPSS Statistics version 24)对指纹图谱数据进行PCA，得出初始值特征值和方差贡献率，见表3。提取主成分以变量重要性投影(VIP)值(特征值)>1为提取标准，最终提取到5个主成分且方差贡献率为90.294%>85%。
| 成分 | 初始特征值 | 提取平方和载入 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 总计 | 方差百分比/% | 累积/% | 总计 | 方差百分比/% | 累积/% | |
| 1 | 10.531 | 42.123 | 42.123 | 9.431 | 37.725 | 37.725 |
| 2 | 5.590 | 22.360 | 64.483 | 4.812 | 19.248 | 56.972 |
| 3 | 3.626 | 14.504 | 78.987 | 3.250 | 12.999 | 69.972 |
| 4 | 1.675 | 6.699 | 85.686 | 2.916 | 11.662 | 81.634 |
| 5 | 1.152 | 4.608 | 90.294 | 2.165 | 8.660 | 90.294 |
3.5.2 多元统计分析
运用SIMCA-P 14.1软件对25个共有峰的峰面积数据进行中心化处理，进行自动拟合对比不同主成分下的R2X值和Q2值，21批采自不同产地、不同品种的陈皮水提物进行主成分分析，经软件分析得到得分(Score)图和负载图(Loading)，见图6。由Score图可见，新生成的变量t1和t2，包含了原始数据84.52%的变化，21批不同来源的陈皮水提物被分成了2类，但是根据相似度和聚类分析，S16，S7与茶枝苷品种较近，在Score图上表现的一致，从陈皮品种分类以及品种之间产地分析，所得结果与相似度评价结果和聚类分析大概一致。为了需求品种、产地之间的差异，由Loading图看出色谱峰8，7，11，原儿茶酸，16，17，橘皮素是造成差异性的关键指标，色谱峰的确认还待进一步研究。
3.6 陈皮水提物对糖尿病大鼠血糖值的影响
诱导第12周时各组大鼠的空腹血糖值，见表4，结果说明，与正常组比较，模型组大鼠的空腹血糖值明显增高(P<0.01)；与模型组比较，陈皮水提物灌胃后各组大鼠的空腹血糖均明显降低(P<0.01)，且陈皮水提物灌胃各组组间差异无统计学意义。
| 组别 | 血糖/mmol·L-1 | 组别 | 血糖/mmol·L-1 |
|---|---|---|---|
| 正常 | 4.66±0.35 | S8 | 11.92±2.072) |
| 模型 | 24.7±2.541) | S9 | 12.29±1.912) |
| S1 | 12.61±1.902) | S10 | 11.91±1.822) |
| S3 | 11.20±1.242) | S14 | 11.59±1.582) |
| S5 | 11.79±1.542) | S16 | 12.31±1.772) |
| S7 | 12.14±1.662) | S18 | 11.89±1.462) |
3.7 陈皮水提物对糖尿病大鼠学习记忆能力的影响
大鼠诱导第12周时，采用Morris水迷宫试验检测认知功能，见表5。结果表明，与正常组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.01)，穿越次数明显减少(P<0.01)；与模型组比较，陈皮水提物各组大鼠的逃避潜伏期均明显缩短(P<0.01)，穿越次数均明显增加(P<0.01)，且陈皮水提物灌胃各组组间差异无统计学意义。
| 组别 | 逃避潜伏期/s | 跨越平台次数/次 | 组别 | 逃避潜伏期/s | 跨越平台次数/次 |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常 | 10.74±3.68 | 8.37±1.84 | S8 | 18.45±5.722) | 5.87±1.452) |
| 模型 | 36.37±9.921) | 2.25±1.031) | S9 | 18.66±8.212) | 5.75±1.662) |
| S1 | 19.32±4.392) | 6.37±1.592) | S10 | 19.41±5.542) | 6.75±1.282) |
| S3 | 18.74±8.362) | 5.37±1.502) | S14 | 20.50±6.942) | 6.25±1.482) |
| S5 | 20.65±6.172) | 5.50±1.922) | S16 | 19.59±8.162) | 6.37±2.262) |
| S7 | 19.55±5.282) | 6.25±1.482) | S18 | 19.72±5.522) | 5.62±2.262) |
3.8 陈皮水提物指纹图谱特征与药效作用的灰色关联度分析
结果表明，陈皮水提物的25个共有峰所代表的化学成分与糖尿病大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数均有一定的关联性(关联度>0.759)，见表6，说明陈皮水提物改善糖尿病大鼠认知能力的作用是多种有效成分共同作用的结果，其中19(橙皮苷)，9(香草酸)，15，4，10，17，5，6，20号峰对作用效果贡献较大，关联度均>0.873。
| 关联序号 | 逃避潜伏期 | 跨越平台次数 | ||
|---|---|---|---|---|
| 峰号 | 关联度 | 峰号 | 关联度 | |
| 1 | 19 | 0.934 | 19 | 0.932 |
| 2 | 9 | 0.912 | 9 | 0.909 |
| 3 | 15 | 0.907 | 15 | 0.909 |
| 4 | 4 | 0.898 | 10 | 0.902 |
| 5 | 10 | 0.894 | 4 | 0.892 |
| 6 | 17 | 0.884 | 17 | 0.883 |
| 7 | 5 | 0.878 | 5 | 0.879 |
| 8 | 6 | 0.878 | 6 | 0.874 |
| 9 | 20 | 0.876 | 20 | 0.873 |
| 10 | 16 | 0.873 | 1 | 0.870 |
| 11 | 1 | 0.869 | 16 | 0.870 |
| 12 | 8 | 0.868 | 14 | 0.867 |
| 13 | 14 | 0.863 | 8 | 0.861 |
| 14 | 12 | 0.861 | 12 | 0.858 |
| 15 | 7 | 0.858 | 7 | 0.856 |
| 16 | 2 | 0.857 | 2 | 0.855 |
| 17 | 18 | 0.854 | 18 | 0.848 |
| 18 | 11 | 0.850 | 11 | 0.847 |
| 19 | 13 | 0.842 | 13 | 0.839 |
| 20 | 25 | 0.833 | 25 | 0.838 |
| 21 | 23 | 0.821 | 23 | 0.818 |
| 22 | 21 | 0.797 | 21 | 0.801 |
| 23 | 3 | 0.776 | 3 | 0.779 |
| 24 | 22 | 0.766 | 22 | 0.764 |
| 25 | 24 | 0.759 | 24 | 0.759 |
3.9 陈皮水提物指纹图谱特征与药效作用的偏最小二乘回归分析
偏最小二乘回归分析的PLSR回归系数及VIP贡献值见图7，图8，结果表明，陈皮提取物的色谱峰中有12个峰与逃避潜伏期呈正相关，其余13个峰与其呈负相关，一般而言，VIP值>1，说明其对模型有显著贡献，峰3，19，1，10，4，17，2，15，25，6，12，16的VIP值>1；陈皮提取物的色谱峰中有12个峰与跨越平台次数呈正相关，其余13个峰与其呈负相关，峰15，1，25，17，3，14，4，8，6，19，2的VIP值>1，说明在陈皮水提物的HPLC指纹图谱中，其相对应的成分对药效指标血糖水平发挥着重要影响。结合灰色关联度分析结果，19，15，4，17，6号峰为5个与糖尿病大鼠认知能力密切相关的成分。
4 讨论
对陈皮水提取的次数(1，2，3次)，提取溶剂体积(50，80，100 mL)，提取时间(30，60，120 min)进行了考察，最终确定了制备陈皮水提物供试品的方法为加入蒸馏水100 mL，并加热回流2 h，重复提取3次。
在流动相选择方面，通过对乙腈-水，甲醇-水及乙腈-0.1%磷酸体系的考察，参照梯度洗脱所得各峰分离效果及配比简单性，最终确定为乙腈(A)-0.1%磷酸(B)体系。在检测波长的选择上，采用270 nm同时测定陈皮水提物指纹图中的色谱峰时均能得到较好的响应值，且峰型良好，因此选择270 nm作为检测波长。
通过化学计量学对其进行主成分分析，中药色谱指纹图谱相似度评价系统、系统聚类3种方法对21批不同品种、产地的陈皮水提物进行数据分析，可将其分为两类，表明陈皮水提物的质量较稳定，为陈水提物的质量控制及溯源研究提供物质基础。
本研究根据预实验选择药效较好的1 g·kg-1，作为给药剂量，实验结果显示，陈皮水提物可以降低糖尿病大鼠的血糖值和改善其认知能力，且不同品种、产地的陈皮水提物对糖尿病大鼠认知功能障碍的保护作用无明显差异。本实验结果显示陈皮水提物可改善糖尿病认知功能障碍，但陈皮水提物的药效成分及作用机制尚不清楚，因此，探讨陈皮中防治糖尿病认知功能障碍的药效成分及作用机制将是下一步研究的重点。
本研究采用了灰色关联度分析和偏最小二乘回归分析的方法[21-22]，研究了陈皮水提物HPLC指纹图谱共有峰与糖尿病大鼠学习记忆之间的关系，表明了陈皮水提物中19，15，4，17，6号峰为5个与糖尿病大鼠认知功能密切相关的成分，初步阐述了陈皮水提物与糖尿病大鼠认知功能的谱效关系，为陈皮水提物改善糖尿病大鼠认知功能的药效物质研究奠定了基础。
