慢性心力衰竭(CHF)是各类心脏疾病的严重表现的终末阶段，也是造成患者死亡的主要原因[1]。心室重构(VR)作为CHF的重要病理机制，其主要表现为心肌肥厚、心腔扩大、心肌纤维化等，可失代偿发展成为泵衰竭、心律失常直至死亡的不可逆性恶性事件。近年来，越来越多的研究者将关注放在了VR中的线粒体能量代谢障碍[2-3]。心脏作为人体能量消耗最大的器官，而线粒体又是参与机体能量供应中最重要的细胞器，故改善心肌线粒体能量代谢为CHF的治疗带来了新的思路[4]。
中医认为，CHF的病机在于心气不足、心阳亏虚，而瘀血阻滞、痰瘀互结是疾病发展变化的关键。对于心之本体而言，气虚则能量供应不足，血瘀、或痰瘀互结则有害产物堆积，长此以往则心肌能量代谢紊乱，病理产物积聚于心肌壁，使心室甚或全心结构发生代偿性改变，是为VR的发生[5]。补益心气即调节能量代谢紊乱、提高供能效率；活血化瘀即清除代谢过程病理产物堆积，故益气活血法指导下、以黄芪、丹参等为代表的中药组方在治疗CHF，肥厚型心肌病等方面取得了显著的疗效，临床上广为沿用[6-8]。为进一步明确益气活血方的效应靶点和可能的作用途径，开展益气活血方对CHF大鼠VR干预作用的实验研究，以期为进一步临床推广应用提供实验依据。
1 材料
1.1 动物
雄性SD大鼠，SPF级，体质量240～260 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK(京)2014-0004，饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验中心。本实验经天津中医药大学实验动物伦理委员会批准(编号TCM-LAEC20170043)，所有实验操作均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。
1.2 药物
益气活血方所用药物为颗粒剂，购自天津中医药大学第一附属医院国药堂，按临床处方剂量比例：黄芪30 g(批号1804002)，丹参15 g(批号18003095)，降香10 g(批号1810029)，三七粉1.5 g(批号1806026)，使用时最终药物质量浓度为2 g·mL-1。卡托普利片(上海衡山药业有限公司，国药准字H31021353)。
1.3 试剂
马松(Masson)复合染色液(南京建成科技有限公司，批号D026)；线粒体蛋白提取试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，批号GMS10013)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物工程有限公司，批号P0010)；视神经萎缩相关蛋白1(Opa1)，线粒体动力相关蛋白1(Drp1)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(美国CST生物科技有限公司，批号分别为#80471，#8570，#8476)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(碧云天生物工程有限公司，批号A0208)；trizol裂解液(Ambion公司，批号15596026)；PrimeScript™ PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号RR420A)。
1.4 仪器
DM3000型光学显微镜(德国Leica公司)，ALC-V8S型小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)，Vevo2100型小动物超声实时影像系统(加拿大Visual Sonics公司)，MK3型酶标仪(美国Thermo生物科技有限公司)，ChemiQ4600型凝胶成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)，ES-2型紫外分光光度仪(日本Malcom公司)，LightCycler 2.0型实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)仪(罗氏设备有限公司)，EPS-300型电脉仪与转膜仪(美国Bio-Rad公司)。
2 方法
2.1 动物分组、造模、给药
40只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为假手术组(10只)和造模组(30只)。参照文献方法[9-10]，假手术组仅接受胸腔切开，前降支穿线但不结扎，心肌组织无损伤。造模组大鼠在左冠状动脉前降支下穿线结扎，以肉眼可见缝线下方心肌色泽灰白、甚至紫绀为结扎成功。造模完成4周后，造模组随机分为模型组、卡托普利组、益气活血组，每组10只。益气活血组予益气活血颗粒20 g·kg-1·d，卡托普利组予卡托普利片13.5 mg·kg-1·d。药物剂量均根据成人临床剂量按照体表面积法计算；假手术组、模型组灌胃(ig)相应体积的生理盐水，每日1次，连续给药4周。
2.2 观测指标及检测方法
2.2.1 超声检测心脏形态学变化
利用超高分辨率小动物超声实时影像系统进行检测，以评价其心脏体积变化情况。大鼠备皮后固定，异氟烷吸入麻醉，探头置于左胸部定位心脏，经胸骨左心长轴切面以M模式超声评价心脏功能。分别检测左心室短轴缩短率(LVFS)，左室舒张末内径(LVDD)，左室收缩末内径(LVDS)，左室舒张末容积(LVD VOL)，左室收缩末容积(LVS VOL)。所有数据均选取连续3个心动周期测量值的平均值。
2.2.2 测定心脏质量指数
造模后8周再次进行超声检测其左室质量指数(LVMI)，结果参照Devereux标准校对公式自动计算。取材前一晩禁水12 h。称量大鼠体质量(BM)，采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速打开腹腔从腹主动脉取血，剪开左心耳，0.9%生理盐水灌注，摘取心脏，滤纸吸干后剔去连带组织及血管部分、全心质量(HM)，计算全心重指数(HWI)＝HM/BM。
2.2.3 Masson染色观察心肌间质胶原组织
将心脏组织固定于10%的甲醛溶液中，经过梯度乙醇脱水、透明、浸蜡和包埋等步骤，制成石蜡切片。经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、苏木素染核、盐酸乙醇分化、自来水冲洗返蓝后Masson复合染色液染色，再经磷钼酸处理、苯胺蓝复染、冰乙酸处理、梯度乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察结果并拍照。Masson染色后心肌纤维呈红色，胶原组织呈蓝色，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，计算心肌间质胶原容积分数(CVF)，CVF＝胶原面积/总面积。
2.2.4 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Opal，Drp1蛋白表达
心肌组织洗净后剪碎至1 cm3置入匀浆器中裂解、研磨至匀浆状态，以线粒体蛋白提取试剂盒提取心肌线粒体蛋白，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其含量。稀释、变性后置于冰上进行SDS-PAGE电泳转膜，膜浸入封闭液中室温下震荡1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入二抗(1：2 000)室温孵育1 h，洗膜后进行ECL化学发光自显影，利用Image J软件计算目的蛋白相对表达量。
2.2.5 Real-time PCR检测Wnt/β-catenin通路相关mRNA表达
trizol法提取RNA，经沉降、洗涤、重悬后反转录cDNA，利用紫外分光光度计测定样品RNA含量。扩增体系为20 μL，扩增程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变形5 s，60 ℃退火34 s，95 ℃延伸15 s，40个循环。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LRP6引物序列为上游5′-CGTCTACTGGACGGACGATG-3′，下游5′-GGTCCC ATTGAGCCTTGTCA-3′，引物长度为187 bp；GSK-3β引物序列为上游5′-GGGACAGTGGTGTGGATCAG-3′，下游5′-GCCGAAAGACCTTCGTCCAA-3′，引物长度为144 bp；β-catenin引物序列为上游5′-ATCATTCTGGCCAGTGGTGG-3′，下游5′-GACAGCA CCTTCAGCACTCT-3′，引物长度为104 bp；β-肌动蛋白(β-actin)为内参，引物序列上游5′-GACA TCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，下游5′-TGGAAATTG TCCATTGG-3′，引物长度为136 bp。每个样本设3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
2.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件，所得数值以
3 结果
3.1 对CHF大鼠心脏形态学的影响
与假手术组比较，模型组LVDD，LVDS，LVD VOL，LVS VOL心室内径、容积指标均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组心室内径、容积指标均显著降低(P<0.01)，益气活血组与卡托普利组之间无显著差异。见表1。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | LVDD/mm | LVDS/mm | LVD VOL/mm3 | LVS VOL/mm3 |
|---|---|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 6.54±0.60 | 4.11±0.34 | 221.10±45.80 | 74.58±14.14 |
| 模型 | - | 8.70±1.351) | 7.19±1.361) | 449.69±151.301) | 303.76±123.071) |
| 卡托普利 | 0.013 5 | 7.97±0.382) | 5.50±0.342) | 351.60±34.062) | 147.63±19.942) |
| 益气活血 | 20 | 7.53±0.792) | 5.27±0.852) | 304.62±66.062) | 130.56±39.762) |
3.2 对CHF大鼠心脏质量指数的影响
与假手术组比较，模型组HWI与LVMI明显升高(P<0.05)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组HWI与LVMI均明显降低(P<0.05)，益气活血组与卡托普利组之间无显著差异。见表2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | HWI/g·kg-1 | LVMI/g·m-2 |
|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 3.17±0.07 | 723.94±113.35 |
| 模型 | - | 3.73±0.081) | 1019.07±189.411) |
| 卡托普利 | 0.013 5 | 3.34±0.092) | 847.50±169.412) |
| 益气活血 | 20 | 2.99±0.132) | 818.97±186.612) |
3.3 对CHF大鼠心肌间质胶原蛋白含量的影响
Masson染色结果显示，镜下可见假手术组心肌间质少量细丝样胶原，模型组心肌间质大量粗大胶原，与模型组比较，卡托普利组与益气活血组胶原含量有所减少。与假手术组比较，模型组CVF显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组CVF均明显降低(P<0.05)，益气活血组CVF明显低于卡托普利组(P<0.05)。见图1，表3。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | CVF/% |
|---|---|---|
| 假手术 | - | 2.09±0.73 |
| 模型 | - | 30.14±15.371) |
| 卡托普利 | 0.013 5 | 15.95±9.642) |
| 益气活血 | 20 | 4.00±5.772) |
3.4 对CHF大鼠心肌线粒体Opa1，Drp1蛋白表达的影响
与假手术组比较，模型组Opa1表达显著降低(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组Opa1表达均显著提高(P<0.01)，益气活血组Opa1表达显著高于卡托普利组(P<0.01)。与假手术组比较，模型组Drp1表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组Drp1表达无显著差异，益气活血组Drp1表达显著降低(P<0.01)，益气活血组Drp1表达显著低于卡托普利组(P<0.01)。见图2，表4。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | Opa1/GAPDH | Drp1/GAPDH |
|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 1.25±0.02 | 0.24±0.01 |
| 模型 | - | 0.45±0.011) | 0.29±0.031) |
| 卡托普利 | 0.013 5 | 0.79±0.012) | 0.28±0.02) |
| 益气活血 | 20 | 1.35±0.012) | 0.20±0.012) |
3.5 对CHF大鼠心肌LRP6，GSK-3β，β-catenin mRNA表达的影响
与假手术组比较，模型组LRP6 mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组LRP6 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)，两组之间无显著差异。与假手术组比较，模型组GSK-3β mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组GSK-3β mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)，两组之间无显著差异。与假手术组比较，模型组β-catenin mRNA表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组与益气活血组β-catenin mRNA表达水平均显著降低(P<0.01)，两组之间无显著差异。见表5。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | LRP6 | GSK-3β | β-catenin |
|---|---|---|---|---|
| 假手术 | - | 1.05±0.09 | 1.05±0.40 | 1.45±0.04 |
| 模型 | - | 9.09±0.321) | 3.46±0.291) | 13.26±0.861) |
| 卡托普利 | 0.0135 | 5.17±0.132) | 1.95±0.022) | 4.98±0.692) |
| 益气活血 | 20 | 4.71±0.672) | 2.17±0.372) | 4.88±0.252) |
4 讨论
CHF作为各种心血管疾病的终末阶段，是一种心输出量下降、无法满足身体的新陈代谢和静脉回流需求的临床综合征，具有慢性、进行性等特征[11]。其发病过程中的心肌结构变化是最重要的病因，也是病情恶化最关键的病理机制[12]。因此，延缓、抑制甚至逆转VR在治疗CHF中具有重要意义。以CHF的发病机制、病理表现及临床症状为依据，运用中医理论分析，认为在VR的认识上应当着眼于“心体”本身变化，其发病根本在于心气亏虚，气虚则不能运血，血行迟滞则为血瘀，痰瘀互结为有形病理产物，堆积于心腔，而成心腔扩张；附着于肌壁，而成心体肥大。故当以益气活血法为主要治法，本研究所用的益气活血方以黄芪为君，丹参为臣，功以益气活血为主；降香、三七粉为佐使，以助行气化瘀之效。
线粒体具有高度动态的特征，及通过不断运动和形态变化形成细胞内动态连续的线粒体网络以发挥其动力学效用。线粒体动力学参与多种基本生物过程，包括线粒体质量控制、能量供应、细胞代谢和细胞凋亡等[13]，在心血管疾病中，大量证据显示线粒体动力学在支持心脏生物能量需求和代谢调节方面起着至关重要的作用。具体而言，线粒体融合是线粒体的必要补充过程，受损线粒体可通过将蛋白质、脂质以及DNA等与健康的线粒体进行交换来恢复正常功能；线粒体分裂则在线粒体质量控制上更为重要，通过分离受损的线粒体并随后通过线粒体自噬清除[14]。有研究表明，心衰大鼠的融合蛋白Opa1表达明显低于正常大鼠[15]，在心力衰竭与扩张型心肌病患者中发现分裂蛋白Drp1表达明显降低[16]，提示线粒体动力学可能与心力衰竭心室重构有一定联系。另有研究发现心肌肥厚动物模型的线粒体动力学以分裂为主，导致线粒体数量增多、质量下降，进而线粒体片段化增加、病理产物堆积[17]；氧化磷酸化不足、能量供应障碍，加剧了心肌的肥厚程度。本实验证明，益气活血方可显著减低CHF大鼠的心肌厚度及心腔容积，并降低心肌间质胶原含量，其作用效果不劣于卡托普利；并进一步证明益气活血方可通过上调Opa1表达水平促进线粒体融合、下调Drp1抑制线粒体分裂，从而抑制线粒体过度分裂、促进其受损健康部分融合以保证线粒体质量，进而调控了线粒体动态平衡，不增加底物的基础上提高了线粒体为心肌供能的效率，潜在地减少了因线粒体数量过多和氧化磷酸化不足而增加的氧化应激过程产物，降低对心肌细胞的损害，从而抑制了VR的进展和恶化。
Wnt糖蛋白家族是一组进化上高度保守的生物体发育调节因子，早已明确其在维持机体自我更新的关键作用，Wnt也是组织形态和结构发生变化的关键驱动因素。有研究显示β-catenin敲除可通过抑制心肌祖细胞分化进而防止VR，有利于CHF的预后，验证了Wnt/β-catenin信号通路与VR的密切关系。在机制研究方面，有大量证据显示Wnt/β-catenin信号通路对线粒体动力学之间的互相作用，如Wnt5a可通过促进Drp1活性、增加线粒体内Ca2＋浓度介导海马神经中的神经元突触异常分化[18]。其中，LRP6作为连接Wnt/β-catenin信号通路与线粒体动力学的纽带，可发动Drp1的激活造成线粒体功能障碍，造成致死性扩张型心肌病和心功能不全[19]。本实验结果显示益气活血方在改善VR的过程中促进线粒体融合、抑制线粒体过度分裂，并伴随着LRP6，GSK-3β，β-catenin等关键基因表达量下调，验证了益气活血方通过调控Wnt/β-catenin促进线粒体动力学的平衡机制，阐释了益气活血方改善VR的内在机制，并在一定程度上丰富了中医药治疗CHF，改善VR的理论内涵。
