甘草是我国最常用的大宗药材之一，素有“十方九草”之美誉，临床使用频率极高，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用[1]。现代药理学研究表明，甘草具有抗炎[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗菌[5]、免疫调节[6]、护肝[7]、降低胆固醇[8]等药理活性。除药用价值外，甘草在食品[9]、农牧业[10]等领域也有广泛应用。
甘草为多基原药材，2015年版《中国药典》规定甘草为豆科植物乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis，光果甘草G. glabra和胀果甘草G. inflata的干燥根及根茎。同时规定指标性成分甘草酸的含量不得低于2.0%[1]。虽然三基原甘草均可入药，但甘草酸含量存在显著差异。本课题组前期对全国四大药材市场的甘草药材进行质量调查，结果发现市售甘草以乌拉尔甘草和光果甘草为主，且光果甘草中甘草酸含量最高[11]。提示光果甘草是研究甘草酸生物合成分子调控机制的良好实验材料。
甘草酸的生物合成受多条代谢途径共同调控，大量文献报道显示植物激素与甘草酸的生物合成密切相关[12-14]，例如适当浓度的茉莉酸甲酯可以提高甘草幼苗中甘草酸的含量，而赤霉素则会降低甘草幼苗中甘草酸的含量[12]。生长素在植物生长发育过程中扮演着重要角色，几乎参与植物生长发育的整个过程。本课题组前期对光果甘草进行了转录组测序分析，发现甘草酸含量变化与光果甘草生长素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAA)(GgARPI)基因的表达水平有密切关系，说明研究GgARPI基因功能有助于解析并调控甘草酸的生物合成过程。
ARPI是植物信号转导途径上的基因，编码一类短周期蛋白Aux/IAA，其结构上有4个保守结构域，在生长素信号转导过程中起着核心调控作用[15]。ARPI基因已经在大豆Glycine max[16]，玉米Zea mays[17]，拟南芥Arabidopsis thaliana[18]，番茄Solanum lycopersicum[19]等植物中被成功克隆，但尚无甘草中的相关报道。本实验选择光果甘草为植物材料，根据本课题组前期对光果甘草转录组测序的实验结果设计特异性引物[20]，克隆其ARPI基因cDNA序列并进行生物信息学分析，为进一步研究甘草酸生物合成的分子调控机制提供参考。
1 材料
A300型聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)，SW-CJ-1D型洁净工作台(江苏苏州苏洁净化设备厂)，DLHR-Q200型恒温震荡培养箱(北京东联哈尔滨仪器制造有限公司)，MDF-U3386S型-80 ℃超低温冰箱(日本SANYO公司)，1-13型离心机(美国Sigma公司)，DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)，H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)，BG-gdsAUTO510型凝胶成像系统(北京百晶生物技术有限公司)，Research Plus型微量移液器(德国Eppendorf公司)，Gene5型酶标仪(美国BioTek公司)。
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(批号71661152)，10×LA PCR Buffer(批号AH80373A)，10 mmol·L-1 dNTP(批号131229018)以及核糖核酸酶(RNase)抑制剂(批号716181BC)均购自北京博迈德生物技术有限公司；pMD-19T载体(批号AI52389A)，BM2000 DNA Marker(批号736568AH)，寡聚胸腺嘧啶引物[Oligo(dT)，批号T2101BA]，GoldenView(批号745879GA)，氨苄青霉素(Amp，批号R1/69/372)，大肠埃希菌DH5α感受态细胞(批号725981FF)，LA Taq DNA聚合酶(批号AI51041A)，6×DNA loading buffer(批号A7301A)均购自北京拜尔迪生物技术有限公司；LB培养基所需药品(北京冠星宇科技有限公司，批号1357059)；一站式DNA/RNA/蛋白提取试剂盒(批号DA18KA6832)，琼脂糖(批号111860)，M-MLV第一链cDNA合成试剂盒(批号AH20013A)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。来自中国医学科学院药用植物研究所的2年生光果甘草，经北京中医药大学刘颖副教授鉴定为豆科植物光果甘草Glycyrrhiza glabra，采收新鲜的根样，-80 ℃保存。
2 方法
2.1 光果甘草总RNA的提取和逆转录
取光果甘草主根于液氮中研磨至粉末，使用一站式DNA/RNA/蛋白提取试剂盒提取光果甘草总RNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量及完整性，利用酶标仪测定不同波长下的吸光度A，计算A260 nm/A280 nm，以确定所提RNA的纯度及浓度。以光果甘草总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，采用M-MLV反转录试剂盒反转录生成cDNA。
2.2 GgARPI基因cDNA序列的PCR扩增
根据甘草的基因组文件(http：//ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/download.pl)确定GgARPI基因的CDS序列(coding sequences)，使用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Primer-BLAST，在基因的CDS两端设计引物，分别为ARPI-F(5′-ACAATGGAAAACAAGGTGGCAT-3′)和ARPI-R(5′-ACTTCCAAGAACCCATGCTGAA-3′)。采用25 μL的PCR扩增体系，包括模板cDNA 1 μL，RNase-free水18.25 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTP 2.0 μL，10×LA PCR Buffer 2.5 μL，LA Taq DNA聚合酶0.25 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s(35个循环)；74 ℃延伸5 min；4 ℃保存。
2.3 GgARPI基因cDNA序列的胶回收、连接、转化及测序
采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，采用胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收纯化。将胶回收产物与pMD-19T载体于16 ℃连接12 h，将连接产物转化进大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂于含50 mg·L-1 Amp的LB培养基平板上，37 ℃倒置培养12 h；随机挑取单菌落，接种于含50 mg·L-1 Amp的LB液体培养基中，于37 ℃，200 r·min-1条件下培养12 h；对菌液进行PCR扩增，阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
2.4 生物信息学分析
采用ContigExpress 9.10对双向测序结果进行拼接，得到GgARPI基因的全长cDNA序列；利用EditSeq 7.10寻找开放阅读框(ORF)，并翻译成氨基酸序列；将所得ORF及氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对；使用在线工具EsPASy-ProtParam分析氨基酸序列的理化性质；使用SOPMA和Swiss-Model分别分析氨基酸序列的二级结构和三级结构；采用NCBI的保守结构域数据库(CDD)预测蛋白的保守结构域；采用在线软件SignalP 4.1 Server预测其信号肽；采用TMHMM Server 2.0预测蛋白跨膜结构域；利用MEGA 6.0进行cDNA序列及氨基酸序列的聚类分析。
3 结果
3.1 光果甘草GgARPI基因克隆
光果甘草总RNA提取结果呈现清晰的18S，28S和5.8S条带，酶标仪检测结果显示A260 nm/A280 nm处于1.8～2.0，表明总RNA质量合格，可用于后续实验。以逆转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，获得了长度约为680 bp的特异性条带，与目的基因长度一致，扩增结果见图1(A)。连接转化后菌液PCR获得了与目的基因长度一致的条带，表明目的基因成功连接至pMD-19T载体，扩增结果见图1(B)。
3.2 GgARPI cDNA及氨基酸序列的BLAST分析
测序拼接结果显示所得片段长度为686 bp，EditSeq 7.10分析显示其ORF全长585 bp，共编码194个氨基酸残基。在GenBank上对所得cDNA序列进行注册，注册登录号为MK638907。ORF序列以及氨基酸序列经NCBI数据库BLAST比对，该片段与大豆的生长素响应蛋白基因相似度86%，蛋白序列的相似度79%，证明已成功克隆得到光果甘草GgARPI cDNA序列。
3.3 GgARPI蛋白理化性质分析
利用在线工具ProtParam对GgARPI cDNA编码的氨基酸序列进行理化性质分析，得蛋白分子式C961H1525N271O301S8，理论相对分子质量21.95 kDa，等电点6.85，其总平均亲水性(GRAVY)-0.813，不稳定指数49.83，表明GgARPI为亲水性蛋白且结构稳定。
3.4 GgARPI蛋白二级结构、三级结构预测
利用SOPMA对GgARPI进行二级结构预测，见图2(A)，GgARPI蛋白序列中含α-螺旋24.74%，延长链19.07%及无规卷曲51.55%，说明GgARPI的二级结构主要以无规卷曲为主。采用在线软件Swiss-Model构建GgARPI蛋白三级结构模型，见图2(B)。
3.5 GgARPI保守结构域、跨膜结构域及信号肽的预测
利用SignalP 4.1 Server在线软件进行信号肽预测，见图3(A)，结果发现原始剪切位点分值和信号肽剪切位点分值为0，说明GgARPI结构中不含信号肽。使用NCBI的CDD预测GgARPI的保守结构域，见图3(B)，结果表明GgARPI属于Aux/IAA超基因家族。运用TMHMM Server 2.0对GgARPI进行跨膜结构域预测，见图3(C)，结果显示蛋白位于跨膜区和膜内部的概率很低，该蛋白基本位于膜外。
3.6 GgARPI cDNA序列及氨基酸序列同源性分析
使用软件MEGA 6.0对克隆所得GgARPI和从GenBank中挑选的16条其他物种的ARPI cDNA序列进行聚类分析，见图4。结果发现GgARPI cDNA序列和鹰嘴豆Cicer arietinum，大豆Glycine max，绿豆Vigna radiata等豆科植物的ARPI cDNA序列聚在一起，表明光果甘草和豆科植物亲缘关系最近；单子叶植物单独聚成一支，其中谷子Setaria italica与光果甘草距离最远，亲缘关系最远。对所得GgARPI序列和GenBank中挑选的19条其他物种的ARPI氨基酸序列进行聚类分析，见图5。结果发现GgARPI与所有豆科植物的ARPI序列聚在一起，表明光果甘草和豆科植物亲缘关系最近；大戟科植物蓖麻和橡胶树聚在一起，与光果甘草亲缘关系较远。
4 讨论
生长素是第1种被发现的具有生长效应的植物内源性激素，在植物生长发育过程中起着重要作用。生长素响应蛋白基因ARPI是一种经典的生长素诱导植物组织特异性表达的转录因子，其广泛分布于众多的高等植物中，能够快速被生长素诱导表达，其编码产物Aux/IAA蛋白是生长素信号转导不可或缺的蛋白[21]。ARPI基因在拟南芥中研究较多，迄今为止，拟南芥中已经分离出29个ARPI基因家族成员[22]。目前，GenBank已注册了1万多条与ARPI基因相关的核苷酸序列，但光果甘草ARPI基因尚未有报道。对生长素应答蛋白的研究主要集中在植物的生长和发育方面，很少关注其对植物次生代谢途径的影响作用。本课题组前期转录组测序研究结果发现，GgARPI对甘草酸生物合成起正调控作用，作为调节生长素信号转导的枢纽因子，GgARPI在激素影响甘草代谢产物生物合成中起到至关重要的作用，其基因表达量直接影响光果甘草三萜类有效成分的含量和产量。本研究首次克隆得到光果甘草GgARPI基因，测序结果表明所得基因长度686 bp，包含1个585 bp的ORF，生物信息学分析表明GgARPI基因编码蛋白为稳定亲水蛋白，平均相对分子质量21.95 kDa，等电点6.85，不含信号肽，无跨膜区域，保守结构域包含1个Aux/IAA超家族结构域，二级结构以无规则卷曲为主，聚类分析表明GgARPI基因种间区分度良好。在后续工作中本课题组将继续分析GgARPI的基因功能，为进一步研究甘草酸代谢途径的分子调控机制奠定基础。
