肿瘤的发生是多种因素综合作用的结果，肿瘤细胞异常增殖，促使了恶性肿瘤形成，且使其凋亡严重减退[1]。故如何抑制癌细胞增殖，加速肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物研究亟需探索和解决的课题。肺癌作为当今社会致死率最高的恶性肿瘤，临床上常有干咳痰少，痰中带血等一系列燥热伤肺表现，尤其在接受放化疗后症状更为明显。中医认为肺癌的重要病机是燥热伤肺。肺作为娇脏，喜润恶燥，患者感受燥热之邪，燥盛则津伤，痰瘀凝聚，火盛则化毒，日久不解，可导致肺癌发生，故清热润燥是肺癌的常用治法[2]。清燥救肺汤源自于《医门法津》，由喻嘉言所创，本方配伍精妙，共奏宣、清、润、养之功效，方的本意是治疗燥热伤肺重症，与肺癌燥热病机甚是相符[3]。
前人已有研究者开始关注并着手进行清燥救肺汤抗肺癌的实验研究，有研究发现，清燥救肺汤能显著降低荷瘤小鼠瘤重，抑制荷Lewis小鼠肺癌细胞活性[4]。亦有学者研究发现清燥救肺汤具有显著抗肺癌功效[5-6]，笔者前期研究提示，清燥救肺汤抗肺癌细胞增殖机制可能与调节糖酵解乳酸水平有关，本文拟采用小鼠肺癌模型，研究清燥救肺汤对肺癌磷酸戊糖能量代谢途径的关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活性及其调控因子小鼠活性氧(ROS)，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基单位gp91phox和p22phox mRNA表达的影响，进一步探索该方的抗肺癌作用机制。
1 材料
1.1 药物
清燥救肺汤组成：生石膏12 g，枇杷叶9 g，党参片12 g，炙甘草3 g，阿胶9 g，苦杏仁9 g，麦冬10 g，霜桑叶9 g，均采购于江西省中医院中药房，经江西中医药大学国家工程中心冯育林教授鉴定为正品。取量为药材10倍的清水，浸泡上述清燥救肺汤药材1 h，取生石膏先煎30 min，而后一起煎煮，待水沸腾后再以小火煎40 min为佳，过滤；第2次再取8倍量的清水，重复之前操作，合并2次所得滤液，置入60 ℃恒温箱，通过机器烘干得到粉末(提取得率为27.14%)，冷却；取出粉末用打粉机打成细粉状，密封，放置4 ℃冰箱保存备用。环磷酰胺(CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号16120927，0.2 g/瓶)。
1.2 动物和瘤株
雄性C57BL6J小鼠50只，适应性饲养，以维持正常饮食，皮毛光泽，体质量(20±2)g，由苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司提供，合格证号SCXK(苏)2016-0003。小鼠Lewis肺癌细胞购自ATCC公司，编号36470TM。本实验符合江西中医药大学实验动物伦理委员会审查批准之要求，伦理审查批准号JZLLSC 2017-0030。
1.3 试剂
胎牛血清(中国医学科学院生物医学工程研究所，批号#TBD15HT)；G6PD，ROS酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海江莱生物科技有限公司，批号分别为#JL20501，#JL20383)；DMEM高糖培养基，PMSF，RIPA组织/细胞裂解液(北京Solarbio公司，批号分别为20170605，20170330，201704119)；trizol总RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，批号CW0581S)；PCR mix，反转录试剂盒(TaKaRa公司，货号分别为RR820A，RR047A)；引物序列通过引物设计软件oligo6自行设计，见表1。
| 引物 | 序列 | 长度/bp |
|---|---|---|
| β-肌动蛋白(β-actin) | 上游5′-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′ | 90 |
| 下游5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′ | ||
| NADPH p22phox | 上游5′-CCATTGCCAGTGTGATCTATCT-3′ | 118 |
| 上游5′-TTGGTAGGTGGTTGCTTGAT-3′ | ||
| NADPH gp91phox | 上游5′-GACAGGAACCTCACTTTCCATA-3′ | 82 |
| 下游5′-TGAAGAGATGTGCAATTGTGTG-3′ |
1.4 仪器
MT-546型CO2细胞培养箱(南京申通医药技术有限公司)；AC54型冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司)；KZ7834型高通量组织研磨机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DNM-9602型酶标仪(北京普朗新技术有限公司)；SAM9001型-80 ℃冰箱(美国Thermo公司)；UV752型紫外-可见分光光度计(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；KSC9857型LongGeneRNA逆转录仪(上海青浦沪西仪器厂)；AFD9600型荧光定量PCR仪(杭州安杰思有限公司)。
2 方法
2.1 小鼠Lewis肺癌细胞培养及造模方法
细胞培养，将肺癌细胞用含10%FBS的培养基于37 ℃ 5%CO2培养。取生长状态最佳的细胞，调节其密度为5×106个/mL，采取0.2 mL/只标准无菌接种于小鼠右腋皮下。
2.2 动物分组与给药
随机分组将小鼠分为模型组，环磷酰胺组，清燥救肺汤高、中、低剂量组，每组10只。接种24 h，模型组每日以生理盐水0.2 mL灌胃；CTX组CTX以50 mg·kg-1·(2 d)-1剂量隔日腹腔注射；经过前期实验[3]证实，清燥救肺汤22，11，5.5，2.75 g·kg-1·d-1分别作用于小鼠后，22 g·kg-1·d-1剂量组对肿瘤细胞不具有抑制作用，反而促进肿瘤增殖，而其他3组则呈现较明显抑制肿瘤细胞增殖作用，其中11 g·kg-1·d-1剂量组为人临床剂量换算成小鼠的剂量，故本实验以11 g·kg-1·d-1剂量为高剂量，清燥救肺汤中、低剂量分别为5.5，2.75 g·kg-1·d-1。在造模2周之前开始每日灌胃给药，造模成功后继续给药2周时间。采取脊椎脱臼法处死小鼠于造模结束后，取其瘤组织放入-80 ℃冰箱备用。
2.3 ELISA检测癌组织中G6PD活性，ROS含量
取肿瘤组织0.1 g，用无菌剪刀将其剪碎，置于无菌的1.5 mL离心管中，加入RIPA裂解液(含PMSF)1 mL，用组织研磨机充分研磨，12 000 r·min-1离心20 min；再按照试剂盒说明书要求进行检测。
2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测癌组织中NADPH氧化酶亚基单位gp91phox和p22phox mRNA表达
取冰冻组织50 mg，用剪刀剪碎，用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水洗净后加入trizol 1 mL，研磨至充分匀浆，15 min后4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，加入三氯甲烷0.2 mL，震荡30 s，静置3 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min；在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，放置10 min；4 ℃，12 000 r·min-1离心15 min，弃上清；75%乙醇对沉淀进行洗涤；4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min，得RNA沉淀；静置2～3 min晾干；加入无核糖核酸酶(RNase)水30～100 μL，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-80 ℃。总RNA提取后按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，以β-actin为内参，置于PCR仪进行mRNA扩增，扩增条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后记录相应Ct和熔解曲线，以确定扩增产物的特异性。所有样品均重复检3次。以2-ΔΔCt方法对目的基因进行相对定量分析。
2.5 统计学分析
采用SPSS 19.0软件分析，方差齐性时，采用单因素方差分析组间差异，其结果以
3 结果
3.1 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌组织G6PD活性，ROS含量的影响
与模型组比较，环磷酰胺组及清燥救肺汤高、中、低剂量组G6PD活性明显降低(P<0.05，P<0.01)；与环磷酰胺组比较，清燥救肺汤高、中、低剂量组G6PD活性明显升高(P<0.05，P<0.01)；与清燥救肺汤高剂量组比较，清燥救肺汤中、低剂量组G6PD活性明显升高(P<0.05，P<0.01)；与清燥救肺汤中剂量组比较，低剂量组G6PD活性明显升高(P<0.05)。与模型组比较，环磷酰胺组及清燥救肺汤高、中、低剂量组ROS含量显著降低(P<0.01)；与环磷酰胺组比较，清燥救肺汤高、中、低剂量组ROS含量显著升高(P<0.01)；与清燥救肺汤高剂量组比较，清燥救肺汤中、低剂量组ROS含量显著升高(P<0.01)；与清燥救肺汤中剂量组比较，清燥救肺汤低剂量组ROS含量显著升高(P<0.01)。见表2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1·d-1 | G6PD/U·L-1 | ROS/U·mL-1 |
|---|---|---|---|
| 模型 | - | 3.622±0.670 | 237.7±3.5 |
| 环磷酰胺 | 0.05 | 0.649±0.6182) | 113.9±4.92) |
| 清燥救肺汤 | 11 | 1.498±0.6012，3) | 125.0±2.92，4) |
| 5.5 | 2.201±0.6712，4，5) | 148.7±2.42，4，6) | |
| 2.75 | 2.883±1.0691，4，6，7) | 211.3±4.62，4，6，8) |
3.2 清燥救肺汤对荷Lewis小鼠肺癌细胞NADPH氧化酶亚基单位gp91phox，p22phox mRNA表达的影响
与模型组比较，环磷酰胺组及清燥救肺汤高、中、低剂量组小鼠癌细胞gp91phox，p22phox mRNA表达显著降低(P<0.01)；与环磷酰胺组比较，清燥救肺汤高、中、低剂量组小鼠癌细胞gp91phox，p22phox mRNA表达显著升高(P<0.01)；与清燥救肺汤高剂量组比较，清燥救肺汤中、低剂量组小鼠癌细胞gp91phox，p22phox mRNA表达显著升高(P<0.01)；与清燥救肺汤中剂量组比较，清燥救肺汤低剂量组小鼠癌细胞gp91phox，p22phox mRNA表达显著升高(P<0.01)。见表3。
| 组别 | 剂量/g·kg-1·d-1 | NADPH gp91phox | NADPH p22phox |
|---|---|---|---|
| 模型 | - | 1.00±0.08 | 1.00±0.09 |
| 环磷酰胺 | 0.05 | 0.04±0.022) | 0.16±0.012) |
| 清燥救肺汤 | 11 | 0.19±0.012，4) | 0.30±0.012，4) |
| 5.5 | 0.47±0.042，4，6) | 0.49±0.042，4，6) | |
| 2.75 | 0.66±0.032，4，6，8) | 0.73±0.052，4，6，8) |
4 讨论
肺癌是目前全球致死率最高的恶性肿瘤，尽管目前有多种治疗手段，但肺癌患者的总体5年生存率仅为16.1%[7]。肺癌属燥热犯肺证，临床症状常表现为干咳、少痰，声音喑哑等一系列燥热伤肺表现，在接受放化疗治疗后肺癌患者症状可能加重，更为明显。中医角度认为肺属于娇脏，其性喜润恶燥，肺癌的重要病机是燥热伤肺，患者感受燥邪，煎灼人体内阴液，使阴液不足。肺为娇脏，喜润恶燥，阴液不足而肺失于清润，肺失于清润则肺的宣发肃降功能失于正常，肺的宣发肃降功能失于正常导致人体津液不布，津聚集为痰，日久循环形成肺部积块，可导致肺癌发生。
明末清初江西籍医家喻昌(字嘉言)编写的医学专著《医门法律》中记载了具有清燥润肺功效的清燥救肺汤，其主治燥热伤肺证。症状如舌干，少苔，心烦口渴，干咳无痰，气逆而喘，胸满胁痛，咽喉干燥，鼻燥，脉虚大而数等。全方由麦冬、霜桑叶、阿胶、生石膏、苦杏仁、党参片、炙甘草、枇杷叶组成，其中霜桑叶为肺家之肝药，其性寒而又质轻，能清透宣发肺金之燥热及邪毒，同时能够治疗肺热燥咳，在方中重用为君药；温燥犯肺，温者属热宜清，燥胜则干宜润，石膏辛甘而寒，功能清泄肺中之燥热，麦冬亦属于甘寒之品，功能养阴润肺，故二者共为臣药，但二者用量少于君药桑叶，从而不妨碍桑叶之清透宣发，君臣相伍，宣中有清，清中有润，是为清宣润肺的常用组合。此外人参功能益气生津，配上甘草又寓以培土生金之意；阿胶功效上能助麦冬养阴润肺，而使得肺治节有权；苦杏仁、枇杷叶均性苦，能降肺气，与桑叶相配，升降平衡，均为佐药。甘草功能调和诸药，是为使药。全方宣、清、润、降四法并用，气阴双补，且宣散不耗气，清热不伤中，滋润不腻膈。燥热犯肺是肺癌的主要病机，而治疗燥热犯肺病证是清燥救肺汤的主要功效，其方主治与肺癌病机病证十分契合。前人已有研究者开始关注并着手进行清燥救肺汤抗肺癌的实验研究，笔者前期研究提示清燥救肺汤抗肺癌细胞增殖机制可能与调节糖酵解乳酸水平有关，本文采用小鼠肺癌模型，研究清燥救肺汤对肺癌磷酸戊糖能量代谢途径的关键酶G6PD活性及其调控因子ROS，NADPH氧化酶亚基单位gp91phox，p22phox mRNA表达的影响，进一步探索该方的抗肺癌作用机制。此研究尚未见报道。
需氧细胞在代谢过程中能够产生一系列产物，其中就包括活性氧，之前对于活性氧的研究主要集中在高浓度ROS诱导细胞凋亡[8]。随着科技的创新与发展，生物信息学者们发现对于某些肿瘤细胞的增殖和凋亡，ROS可以起到双向调控的作用[9-11]。ROS在浓度较低时，其可以激活某些转录因子，这对细胞的增殖和分化反而起到了促进作用[12]。本实验从肿瘤细胞产生的ROS，氧化压力增加可以诱导细胞内G6PD的表达增强着手，研究论证ROS含量与G6PD活性之间的关系。磷酸戊糖代谢可为肺癌肿瘤细胞DNA合成提供重要原料核苷酸，该途径受G6PD的调控，肿瘤细胞产生过多的ROS，氧化压力增加可以诱导细胞内该酶的表达增强[13]。作为磷酸戊糖途径的第一个酶，G6PD的活性决定了6-磷酸葡萄糖进入磷酸戊糖途径的流量大小，因此G6PD为限速酶。NADPH氧化酶是机体活性氧生成的主要酶类之一[14]，NADPH氧化酶是一个包含膜细胞结合色素b558(NADPH氧化酶p22phox转移电子酶亚基单位和gp91phox催化亚基单位异源二聚体)的多组分酶。
本实验结果显示，清燥救肺汤能够抑制荷Lewis肺癌小鼠G6PD活性；清燥救肺汤能够减少荷Lewis肺癌小鼠ROS的含量；清燥救肺汤能够抑制荷Lewis肺癌小鼠癌细胞NADPH氧化酶p22phox转移电子酶亚基单位及gp91phox催化亚基单位mRNA表达。
以上实验结果表明清燥救肺汤可能通过抑制NADPH氧化酶表达，减少ROS含量，从而抑制G6PD的表达，减少磷酸戊糖代谢途径提供的肺癌细胞DNA合成原料，发挥抑制肺癌细胞能量代谢及细胞增殖的功效。随着中医界对肺癌研究的不断深入，中药治疗肺癌的临床疗效显著，但还存在很大的探索空间[15]。
