骨质疏松症(OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病。随着人口老龄化进程的加速，骨质疏松症的发病率仅次于心血管疾病、糖尿病，跃居慢性疾病的第3位。近几年骨质疏松的发病人数在我国已经明显上升，在60～70岁阶段，约33%的女性和20%的男性患有该疾病，对中老年人的生命安全、身体健康等形成一定的危害与威胁[1]。到2050年中国骨质疏松症或骨密度低的患者将达到2.12亿[2]，也就是说，全球骨质疏松病人总量中有超过1/2患者来自中国大陆地区。中医学有“肾藏精，主骨生髓”的理论，骨质疏松症可归属于“肾虚”“虚劳”“骨痹”“骨痿”等疾病范畴[3]。中医学认为，肾主骨，肾虚是绝经后骨质疏松症发生的始动病机[4-5]，因此治疗骨质疏松因从补肾益精着手，左归丸出自张景岳的《景岳全书》，作为补肾的经典代表方剂符合骨质疏松症可归属于“肾虚”“虚劳”“骨痹”“骨痿”等疾病范畴松症的中医治疗法。左归丸治疗骨质疏松症的疗效明确，且对于一些基本的机制研究亦取得一定进展[6]。大量的实验研究证明现代研究也证实左归丸具有类似刺激素样的调节作用，不仅能调节骨代谢标志物，如增加骨钙素含量、降低降钙素含量[7-8]，升高大鼠骨量，改善骨小梁细小、稀疏和三维结构破坏的状况[9-10]，降低骨髓基质细胞白细胞介素-1(IL-1)和成骨细胞IL-6的表达[11]，还能通过调节Notch信号通路，转化生长因子-β1/Smad信号通路途径，分泌型糖蛋白(Wnt)/β-链蛋白信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路[12-15]，从而达到纠正钙代谢紊乱，防治骨质疏松症的目的。新型上皮钙通道瞬时受体电位通道V5(TRPV5)作为TRP超家族中钙离子高选择性阳离子通道，在机体钙离子跨上皮转运方面发挥重要作用，参与调节整个机体的钙平衡[16]。其介导的肾钙及骨钙转运过程与骨质疏松症的钙代谢紊乱有着密切的联系。本研究拟基于TRPV5介导的肾钙、骨钙转运通路探讨补肾经典方剂左归丸对骨质疏松症模型大鼠的疗效及作用机制。
1 材料
1.1 动物
6月龄雌性SPF级SD大鼠48只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物合格证号43004700022760，许可证号SYXK(湘)2015-0003。所有动物实验设计和方案均获得湖南中医药研究院动物伦理委员会的同意和批准，伦理号2016-0019。
1.2 药物与试剂
左归丸配方由熟地24 g，山药12 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，川牛膝12 g，菟丝子12 g，鹿胶12 g，龟胶12 g(药材由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供，湖南省中医药研究院附属医院蔡敏荣主管中药师鉴定)。尼尔雌醇[上海医药(集团)有限公司新华联制药厂，国药准字H31021647，2 mg/片]；钙(Ca)，碱性磷酸酶(AKP)生物化学试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20170801，20170729)；TRPV5，钙结合蛋白-D28K(CaBP-D28K)，钠钙交换体(NCX1)兔抗体，β-肌动蛋白(β-actin)鼠抗体，辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，HRP山羊抗兔IgG(美国Proteintech公司，批号分别为00008699，00005713，09000095，10004413，20000002，20000003)；质膜钙离子ATP酶(PMCAIb)兔抗体(英国Abcam公司，批号GR174287-1)；蛋白酶抑制剂(北京金泰宏达生物科技有限公司，批号583794)。
1.3 仪器
XR-26型双能骨密度仪(美国North-Land公司)；164-5050型制造电泳仪(美国Bio-Rad公司)；H165R型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；PW-812型全自动酶标洗板机，MB-530型多功能酶标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司)；DYCP-31DN型电泳仪，DYCZ-40D型转膜仪(北京六一生物科技有限公司)。
2 方法
2.1 动物模型复制
采用背侧入路双侧卵巢切除法进行造模[17]。10%水合氯醛溶液对大鼠按3.3 mL·kg-1体质量腹腔注射进行麻醉，将假手术组大鼠样本背部切开，进入腹腔，将卵巢找到，从其旁将一定量的脂肪(1 g左右)剪除。将切除卵巢组大鼠距脊柱外侧约1 cm与背部腋中线交叉部位的皮肤切开，腹腔打开，行两侧卵巢摘除术。伤口消毒7 d，观察伤口愈合情况。
2.2 动物分组及给药
随机将大鼠分成左归丸高、低剂量组、西药组、模型组、正常组及假手术组，每组8只。6组大鼠自由摄食、饮水。术后3月行骨密度检测验证模型复制成功，进行分组治疗干预。按70 kg的成人1 d服用左归丸的生药量为105 g计算，人的给药量为即1.5 g·kg-1·d-1，按照动物与人体的表面积换算法，大鼠的临床等效给药量应为9.45 g·kg-1·d-1。每组大鼠的给药体积均为20 mL·kg-1·d-1，根据大鼠每日给药量与给药体积，将药物水煎2次，合并过滤浓缩制备左归丸低浓度煎剂为0.48 g·mL-1(相当于临床等效给药量)、左归丸高浓度煎剂1.92 g·mL-1(相当于临床4倍量)。中药低剂量组给予左归丸低浓度煎剂，给药剂量为9.6 g·kg-1·d-1；中药高剂量组给予左归丸高浓度煎剂，给药剂量为38.4 g·kg-1·d-1；西药组给予尼尔雌醇1 mL·kg-1·d-1灌胃，使用前配成混悬液(质量浓度为0.167 g·L-1)，1次/周，其余时间予生理盐水20 mL·kg-1·d-1灌胃；假手术组和模型组的大鼠给予体20 mL·kg-1·d-1的生理盐水灌胃饲服。以上干预治疗均持续3个月。
2.3 指标检测
2.3.1 大鼠一般状态观测
对样本大鼠体态、皮毛及活动每日状态进行观测，观测大便状态，肛门颜色，做好样本饮水量、食量、体质量波动记录。
2.3.2 大鼠离体股骨上1/3骨密度(BMD)测定
采用双能X射线骨密度仪进行大鼠样本股骨上1/3 BMD测试，采用The Small Subject Scout Scan软件进行数据研究。具体检测分析过程中需要采用1.0 mm×1.0 mm分辨率及60 mm·s-1的扫描速度进行，而对于扫描长度来说则可以根本实际需要进行调节，扫描的宽度通常应控制于10 cm，CV＝0.82%～1.24%(组内)。
2.3.3 苏木素-伊红(HE)染色观察骨组织病理学变化
常规石蜡包埋5 μm切片后进行HE染色，光镜下观察60 ℃烤片1～2 h；切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中10 min，2次。然后依次在100%，100%，95%，85%和75%乙醇，每级放置5 min。再用蒸馏水浸洗5 min；苏木素染5～10 min，蒸馏水冲洗，返蓝；伊红染3～5 min，蒸馏水冲洗；梯度乙醇(95%～100%)脱水，每级5 min(或者直接把片子烤干)。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。
2.3.4 骨代谢标志物检测
腹主动脉血提取出来后静置，于6 000～1万r·min-1离心30 s，血清随之重新提取出来，待测骨代谢标志物。按Ca测试盒和碱性磷酸酶测试盒说明书步骤，采用血清生化检测(微板法)检测血清中AKP和血清Ca的含量。
2.3.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠骨组织中钙转运通路相关蛋白的表达
用锡箔纸包好股骨标本，放入液氮中，30 s后取出，将其敲碎，并将碎末转移到研钵中，加入适量液氮研磨成粉末，将研磨好的粉末放入试管中，并加入冰预冷的RIPA裂解液300 μL，反复吹打直至看不见组织块。将裂解完毕的细胞1 200 r·min-1离心15 min，分装上清，向离心管(规格为0.5 mL)之中移入细胞。绘制蛋白标准曲线，计算蛋白浓度。灌胶、上样，根据蛋白定量的结果，计算出所有样品取样量，计算的基本标准为50～100 μg(各种样品总蛋白)，电泳、转膜。按TRPV5，CaBP-D28K，NCX1，PMCAIb，β-actin所在位置进行切胶。室温条件下于TBST溶液(含5%脱脂奶粉)内封闭膜(载蛋白质条带)60 min。然后加入含有稀释一抗(β-actin 1∶5 000，PMCA1b 1∶1 000，TRPV5 1∶1 000，NCX1与CaBP-D28K1 ∶500)，振荡孵育并且要求应保持4 ℃这一基本温度不变前提下过夜，清洗采用TBST液进行，加入用TBST稀释HRP标记的二抗，兔抗稀释比例1∶6 000，鼠抗稀释比例1∶5 000，将稀释后的二抗与膜共同孵育90 min。洗涤后，采用ECL化学发光显示液曝光。将曝光后的底片扫描，并用Quantity One专业灰度分析软件进行分析。
2.4 统计学处理
采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，单因素方差分析多组对比，t检验两组对比，结果用
3 结果
3.1 对去势大鼠一般状态的影响
正常组皮毛光泽，反应迅速，饮食正常，好动，体质量渐增。造模后4周，模型组大鼠弓腰塌背体态，皮毛粗糙，反应慢，开始出现活动和进食减少等。尼尔雌醇组、左归丸各组中，前述症状全部出现相应改善，改善效果最理想的为高剂量组。
3.2 对去势大鼠离体股骨上1/3 BMD的影响
正常组和假手术组差异无统计学意义。与假手术组比较，模型组大鼠BMD显著降低(P<0.01)；与模型组比较，左归丸高剂量组和尼尔雌醇组大鼠BMD均得到改善(P<0.01)。与模型组比较，左归丸低剂量组大鼠样本BMD升高无统计学意义。见表1。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | 1/3BMD/mg·cm-2 |
|---|---|---|
| 正常 | - | 242.0±15.3 |
| 假手术 | - | 240.0±18.5 |
| 模型 | - | 201.0±17.71) |
| 尼尔雌醇 | 0.001 67 | 233.1±15.72) |
| 左归丸 | 9.6 | 214.0±17.3 |
| 38.4 | 235.7±15.12) |
3.3 对去势大鼠股骨病理组织的影响
正常组大鼠骨质疏松样改变不明显，骨小梁粗细均匀，结构完整，骨小梁之间的连接较好，脂肪细胞和骨细胞形态清晰。模型组大鼠可见骨松质结构改变，部分骨小梁明显纤细或出现断裂现象，相里间的连接不完整，符合骨质形态学破坏表现，提示造模成功。而左归丸高剂量组和尼尔雌醇组可见骨松质骨小梁改变不明显，骨小梁间隔稍增宽，髓腔稍扩大但未见明显纤细、断裂，相互连接较好，结构完整。见图1。
3.4 对去势大鼠骨代谢标志物的影响
正常组和假手术组差异无统计学意义。与假手术组比较，模型组血钙显著下降(P<0.01)；与模型组比较，左归丸高剂量组和尼乐雌醇组血Ca均显著上升(P<0.01)；各组TRACP值差异无统计学意义。见表2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | Ca值 | TRACP值 |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 2.77±0.14 | 0.66±0.12 |
| 假手术 | - | 2.88±0.26 | 0.54±0.16 |
| 模型 | - | 1.36±0.121) | 0.68±0.09 |
| 尼尔雌醇 | 0.001 67 | 1.86±0.242) | 0.52±0.13 |
| 左归丸 | 9.6 | 1.74±0.40 | 0.73±0.14 |
| 38.4 | 1.75±0.262) | 0.64±0.13 |
3.5 对去势大鼠骨组织中TRPV5介导的钙转运通路相关蛋白的影响
与正常组比较，假手术组大鼠各蛋白表达差异无统计学意义；与假手术组比较，模型组各蛋白表达均上调(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，左归丸高剂量组中TRPV5蛋白表达显著下调(P<0.01)，各干预组中的CaBP-D28K与NCX1蛋白表达均有不同程度的下调(P<0.05，P<0.01)，PMCA1b蛋白表达在左归丸低剂量组和尼尔雌醇组内表达均有不同程度下降(P<0.05，P<0.01)。见表3和图2。
| 组别 | 剂量/g·kg-1 | TRPV5/β-actin | CaBP-D28K/β-actin | NCX1/β-actin | PMCA1b/β-actin |
|---|---|---|---|---|---|
| 正常 | - | 0.14±0.02 | 0.22±0.02 | 0.16±0.01 | 0.09±0.03 |
| 假手术 | - | 0.15±0.03 | 0.23±0.03 | 0.16±0.01 | 0.08±0.03 |
| 模型 | - | 0.25±0.022) | 0.48±0.061) | 0.20±0.011) | 0.26±0.062) |
| 尼尔雌醇 | 0.001 67 | 0.20±0.02 | 0.25±0.054) | 0.16±0.013) | 0.13±0.033) |
| 左归丸 | 9.6 | 0.24±0.02 | 0.29±0.053) | 0.16±0.023) | 0.12±0.024) |
| 38.4 | 0.17±0.024) | 0.34±0.033) | 0.15±0.024) | 0.18±0.02 |
4 讨论
女性的雌激素水平以及她们的卵巢功能在闭经条件下全部会出现下降，骨形成因此滞后于骨吸收，骨代谢会因此失衡。骨质疏松症(绝经女性)骨代谢特征可以通过去势大鼠动物模型样本进行有效模拟。Ca水平调节(主要是指体内关键就在于骨组织，表现在骨吸收与骨形成过程中，骨吸收(破骨细胞)的重点在于钙离子跨膜转运，由3个紧密偶联(流入、胞质扩散、挤出)组成，研究表明新型钙通道TRPV5因子几乎在所有具有钙离子膜转运的组织及器官当中表达，是介导破骨细胞分化过程中重要的“钥匙”[18]，且有其他钙转运相关蛋白(于人、鼠破骨细胞)相伴，PMCA1b等共同表达。吸收面(破骨细胞)刷状缘(微绒毛形成)为TRPV5主要分布区，破骨细胞(含TRPV5)会导致骨吸收陷窝，其实质上属于能对破骨细胞钙离子吸收进行介导的一个基本通道蛋白。
人、鼠破骨细胞内均有钙通道CaBPD28K表达。学者指出，破骨细胞骨吸收过程中会有CaBPD28K参与，就此在某种程度上影响钙代谢。NCX1是位于细胞基底侧膜的钙离子转运体，是一种基本转出机制(对钙离子跨膜转运有介导作用)，也是介导破骨细胞骨吸收和破骨细胞内钙离子运输的重要蛋白[19]。NCX1通过催化钠与钙离子的跨膜交换，实现其在骨吸收过程中介导钙离子的转运作用，对调控细胞内的Ca2＋浓度具有重要意义[20-21]。骨吸收(NCX1介导)增强会丢失骨量，就此导致骨质疏松，对NCX1功能状态(破骨细胞)进行抑制时会阻碍骨吸收。PMCA的相对分子质量是140 kDa，是P型ATPase家族中最大的[22]，他是钙离子的流出泵(通常具有高亲和力)，Ca含量(细胞中)是否能保持稳定状态主要取决于这种物质，真核细胞中全部有PMCA。其PMCA1-4这类基因编码亚型(4个)已被发现。人、鼠破骨细胞内有PMCA1b表达表明，PMCA1b在破骨细胞骨吸收时可能同样也参与其中了。
本研究发现，模型组去卵巢大鼠血Ca浓度和BMD均下降，标志着骨质疏松模型大鼠造模成功。采用尼尔雌醇与左归丸干预后，大鼠BMD与血Ca浓度均有上升，提示雌激素与左归丸均有一定抗骨质疏松的作用。模型组大鼠破骨细胞中TRPV5，CAPB-D28K，PMCA1b，NCX1等介导破骨细胞吸收钙离子的重要通道蛋白均有升高，而尼尔雌醇及左归丸均可不同程度的降低上述蛋白的表达，提示去卵巢大鼠破骨细胞的骨吸收增强，而雌激素及左归丸的抗骨质疏松机制有可能是通过抑制TRPV5介导的破骨细胞的骨吸收而起作用。
