溃疡性结肠炎(UC)是一种反复发作的肠道免疫炎症性疾病，是由多种因素刺激导致的机体免疫反应异常，免疫系统过度活化，产生自身抗体进而激活补体系统，放大炎症反应，释放过量炎症介质，导致非可控性炎症，引起肠黏膜组织的持续损伤，因此抑制免疫炎症是治疗溃疡性结肠炎的核心[1]。Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是参与肠道免疫炎症反应的“明星通路”，该通路的活化是多种免疫细胞发挥免疫活性并释放大量炎症介质的主要物质基础，但过度的活化则导致了炎症反应处于非可控状态，引起组织的持续损伤，导致疾病迁延难愈，因此该通路也成为UC治疗研究中的热点[2-4]。
寒热并用法是中医药治疗UC临床常用治法之一[5-7]，干姜-黄连是体现寒热并用法的主要药对，该药对具有抑制免疫炎症，治疗UC的作用[8]。研究表明干姜的有效成分6-姜烯酚和黄连的有效成分黄连素均是抑制炎症反应的有效单体[9-10]。为进一步明确两种单体配伍后抑制肠道免疫炎症的作用和机制，课题组开展了黄连素，6-姜烯酚单独和联合应用对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮TLR4/NF-κB信号通路影响的实验研究，揭示其作用和机制，为寒热药物并用提供科学依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性昆明种小鼠50只，体质量(20±5) g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(陕)2012-003，动物饲养和实验均在陕西中医药大学医学科研实验中心进行，该实验经陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准。
1.2 药品及试剂
6-姜烯酚(纯度98%，宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号17073001)；黄连素(纯度98%，宝鸡市辰光生物科技有限公司，批号17072601)；葡聚糖硫酸钠(DSS)(美国MP Biomedicals公司，批号160110)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒(美国R&D公司，批号分别为340104，340116)；RNA提取试剂盒，cDNA反转录试剂盒，PCR检测试剂盒，蛋白Marker，蛋白免疫印迹法(Western blot)试剂盒发光液，BCA蛋白测定试剂盒，Loading buffer(北京全式金生物技术有限公司，批号分别为ET111-01，AT311-02，AD101-12，BM111-01，DW101-02，DQ111-01，DL101-02)；5倍Tris-甘氨酸电泳缓冲液，10倍电转液，10倍TBST，RIPA蛋白裂解液，脱脂奶粉，苏木素-伊红(HE)染色试剂(北京索莱宝科技有限公司，批号分别为T1070，D1060，T1081，ROO20，LP0031B，G1121)；TLR4，NF-κB p65一抗(北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-1021R，bsm-32305R)；β-肌动蛋白(β-actin)一抗，羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为BA2305，BM3894)。
1.3 仪器
TL988-Ⅳ型IANLONG Real-time PCR System(西安天隆科技有限公司)；4-20R型4 ℃离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；YT-CJ-1ND型超净工作台(北京亚泰科隆仪器技术有限公司)；ELX808型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；ZY5型Western blot电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)；T10型组织匀浆机(德国IKA公司)。
2 方法
2.1 分组及处理
实验动物按体质量大小排序编号后，随机分为正常组，模型组，6-姜烯酚组，黄连素组，6-姜烯酚合黄连素组。小鼠溃疡性结肠炎模型建立参考文献方法[11]。模型组，6-姜烯酚组，黄连素组，6-姜烯酚合黄连素组用相对分子质量为36 000～50 000的DSS配置成2%浓度的水溶液不限量自由饮用，出现稀便，黏液脓血便为造模成功。2周后开始灌胃给药，黄连素按照参考文献剂量[12]给药，因黄连-干姜药对临床应用多剂量相等，故6-姜烯酚给药剂量等同于黄连素，6-姜烯酚组及黄连素组分别给予6-姜烯酚、黄连素100 mg·kg-1；6-姜烯酚合黄连素组给予黄连素和6-姜烯酚共200 mg·kg-1，模型组和正常组均给予等量生理盐水，每日1次，给药持续20 d。
2.2 HE染色观察结肠组织形态学变化
取结肠组织，10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色观察结肠组织形态学变化。
2.3 ELISA检测血清TNF-α，IL-1β含量
末次给药后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏采血，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，ELISA法检测血清中TNF-α，IL-1β水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
2.4 Western blot检测结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65蛋白表达
刮取结肠上皮组织，研钵粉碎，加入RIPA缓冲液，PMSF后匀浆，12 000 r·min-115 min离心，取上清液；BCA法测各组织样本蛋白浓度，根据浓度调整体积至各样本蛋白上样量一致，根据蛋白溶液体积加入等量5倍上样缓冲液，上样前将样品100 ℃煮沸5 min变性；SDS-PAGE电泳，根据标记蛋白位置切下含36 kDa GAPDH和21 kDa Racl在内的胶；转膜，加入5%脱脂牛奶封闭液，37 ℃摇床上孵育封闭1 h，加入脱脂牛奶稀释过的一抗(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗3次，每次10 min；二抗工作液孵育(1∶5 000)，室温下摇床孵育1 h，TBST漂洗膜2次，每次10 min；进行化学发光反应，显影，拍照，分析数据。
2.5 Real-time PCR检测结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65 mRNA表达
取结肠上皮组织100 mg，加入约组织裂解液1 mL制成组织匀浆，提取总RNA。取总RNA 2 μL按照反转录试剂盒说明书方法合成cDNA，合成后测定cDNA浓度，备用。PCR法检测mRNA表达。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成，选用β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，TLR4上游引物5′-GCCGGAAAG TTATTGTGGTG-3′，下游引物5′-ATGGGTTTTAGG CGCAGAGTT-3′，片段长度20 bp；NF-κB p65上游引物5′-GGGCATGCGTTTCCGTTACA-3′，下游引物5′-ATGTGGATGAGGCCGGTGAG-3′，片段长度20 bp; β-actin上游引物5′-ATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游引物5′-CAGCACTGTGTTGGCATACA-3′，片段长度20 bp，反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，共30个循环72 ℃终末延伸10 min。相对定量法计算各指标mRNA的2-ΔΔCt值。
2.6 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行数据的整理分析，数据以
3 结果
3.1 对UC小鼠结肠组织病理学的影响
正常组小鼠结肠组织结构正常，腺体排列整齐，结肠上皮组织完整、黏膜光滑，无缺损，黏液层正常。模型组小鼠结肠组织结构异常，腺体排列紊乱，部分腺体萎缩、破坏甚至丢失，黏液层部分丢失，黏膜表面出现缺损，受损部位可见炎细胞浸润、聚集。6-姜烯酚组小鼠结肠组织结构基本恢复正常，黏膜缺损明显减轻，受损部位炎细胞浸润减少。黄连素组小鼠结肠组织结构基本正常，黏膜下层仍可见大量充血，黏膜缺损减轻，但腺体排列依旧紊乱，受损部位炎性细胞减少，黏液层尚未恢复。6-姜烯酚合黄连素组结肠组织结构基本恢复正常，黏膜缺损逐渐修复，炎细胞浸润显著减少，黏液层逐渐恢复。见图1。
3.2 对UC小鼠的结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65 mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65 mRNA相对表达量显著增高(P<0.01)；与模型组比较，6-姜烯酚组，黄连素组，6-姜烯酚合黄连素组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65 mRNA相对表达量显著降低(P<0.01)；与6-姜烯酚合黄连素组比较，6-姜烯酚组、黄连素组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01)。见表1。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | TLR4 | NF-κB p65 |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 1.07±0.03 | 1.17±0.04 |
| 模型 | - | 1.38±0.021) | 1.52±0.031) |
| 6-姜烯酚 | 100 | 1.21±0.032，3) | 1.32±0.052，3) |
| 黄连素 | 100 | 1.19±0.042，3) | 1.28±0.032，3) |
| 6姜烯酚合黄连素 | 200 | 1.12±0.022) | 1.20±0.032) |
3.3 对UC小鼠的结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65蛋白相对表达量显著增高(P<0.01)；与模型组比较，6-姜烯酚组、黄连素组、6-姜烯酚合黄连素组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65蛋白相对表达量显著降低(P<0.01)；与6-姜烯酚合黄连素组比较，6-姜烯酚组、黄连素组小鼠结肠上皮组织TLR4，NF-κB p65蛋白表达量显著升高(P<0.01)。见表2，图2。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | TLR4/β-actin | NF-κB p65/β-actin |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 0.77±0.07 | 0.78±0.07 |
| 模型 | - | 1.48±0.101) | 1.50±0.081) |
| 6-姜烯酚 | 100 | 1.27±0.062，3) | 1.27±0.092，3) |
| 黄连素 | 100 | 1.22±0.072，3) | 1.21±0.102，3) |
| 6姜烯酚合黄连素 | 200 | 0.92±0.072) | 0.96±0.092) |
3.4 对UC小鼠血清TNF-α，IL-1β含量的影响
与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α，IL-1β含量显著增高(P<0.01)；与模型组比较，6-姜烯酚组，黄连素组，6-姜烯酚合黄连素组小鼠结肠上皮组织TNF-α，IL-1β含量显著降低(P<0.01)；与6-姜烯酚合黄连素组比较，6-姜烯酚组、黄连素组小鼠结肠上皮组织TNF-α，IL-1β含量显著升高(P<0.01)。见表3。
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | TNF-α | IL-1β |
|---|---|---|---|
| 正常 | - | 70.56 ±16.10 | 68.81±19.84 |
| 模型 | - | 311.10±26.671) | 445.40±45.071) |
| 6-姜烯酚 | 100 | 207.00±21.662，3) | 257.00±34.752，3) |
| 黄连素 | 100 | 180.80±16.962，3) | 215.50±26.212，3) |
| 6姜烯酚合黄连素 | 200 | 146.70±14.092) | 143.10±21.282) |
4 讨论
非可控性炎症是导致溃疡性结肠炎反复发作，不断进展的主要原因，因此控制炎症反应是治疗UC的主要策略[13]。研究表明Toll样受体与非可控性炎症的发生、发展密切相关[14]。Toll样受体是存在与细胞表面的模式识别受体，主要负责对入侵的病原微生物进行识别并将信号转导至下游启动固有免疫进程，同时Toll样受体亦是固有免疫和特异性免疫之间的桥梁，处于细胞表面的Toll样受体能触发细胞内的信号传导，促使细胞释放大量炎症因子，适度的炎症反应对机体是有利的，有助于机体快速而有效地清除各种病原微生物及潜在的危险，一旦完成异物清除及组织修复后炎症将适时终结，所以炎症是机体应对病原体感染和多种损伤因子产生的防御反应，是机体保持健康的重要条件[15]。炎症反应过轻将无法清除病原微生物导致机体长期处于感染状态，过重的炎症反应则会引起机体损伤。而溃疡性结肠炎的发生正是由于病原体的大量入侵，Toll样受体过度活化，激活免疫细胞启动异常免疫反应，免疫细胞在清除病原体的过程中释放过量促炎因子，导致肠道长期处于非可控性炎症状态，进一步加剧黏膜屏障的破坏[12]。目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TLRs家族成员有11个，其中了解比较清楚的与溃疡性结肠炎发病关系比较密切的主要有TLR2，TLR4和TLR9[16]，其中TLR4是目前研究的热点，临床研究发现我国UC患者结肠上皮组织细胞中TLR4及其下游NF-κB表达显著上调[17]。细胞表面的TLR4触发细胞内信号的传导，通过关键效应蛋白髓系分化因子88，IL-1受体相关激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子6等进行上下游信号传递，最终激活NF-κB，其亚基NF-κB p65被磷酸化后会释放TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10等炎症因子，这些物质会促进细胞的增殖和修复，但过度活化NF-κB则会引起炎症介质和细胞因子过度释放，最终形成非可控性炎症，使UC不可避免的发生，持续的炎症阻碍了黏膜的再生，导致组织损伤，并最终使疾病朝着炎-癌转化的方向发展[18-19]。因此TLR4/NF-κB信号通路也成为防治溃疡性结肠炎及防止炎-癌转化的重要治疗靶点。
干姜-黄连是在中医寒热并用法指导下的治疗UC常用药对之一，是众多治疗UC的寒热并用方剂的主要组成药物，单纯从药物的寒热药性分析，寒热并用似乎是矛盾的，但在实际应用中寒热药物并用却表现出了良好的治疗效果，从传统医学的角度很难阐明寒热药物并用的科学意义，而从现代医学的角度，通过药物的有效单体之间的组分配伍则能更直观的说明寒热药物并用的意义。实验研究表明6-姜烯酚是干姜发挥药效的主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抑制血管平滑肌增殖[20-23]等多重效应；黄连素是已经应用于临床治疗肠道炎症性疾病的有效药物[24]，近年来研究发现其在能够降血脂保护心血管、通过影响大脑内神经递质发挥抗焦虑作用、增加胰岛素敏感性来治疗糖尿病，这些结果提示该药物在预防和治疗心脑血管疾病、糖尿病、消化道疾病等重大疾病方面有着不可低估的应用前景[25-26]。这两种单体均具有抗炎的作用，两者联合应用后会产生什么样的效果呢？本此实验结果表明，黄连素，6-姜烯酚，黄连素联合6-姜烯酚均能有效调节肠道上皮组织TLR4/NF-κB信号通路的过度活化，通过抑制TLR4受体的表达进而抑制NF-κB蛋白的磷酸化，减少下游TNF-α，IL-1β等炎症因子的释放，最终达到控制炎症反应的作用，其中黄连素联合6-姜烯酚的作用要明显高于黄连素，6-姜烯酚的单独应用，表现出了显著的协同增效作用。
综上所述，黄连素，6-姜烯酚分别是黄连、干姜的治疗UC的有效成分之一，这2种有效成分均具有抑制免疫炎症反应的作用，其药理机制与调节TLR4/NF-κB信号通路的过度活化有关，这两种有效成分的联合应用表现出了显著的协同增效作用，这也部分揭示了寒热药物配伍治疗UC的科学内涵。
